基于智能手機同時檢測4種獸藥殘留的免疫芯片技術

吳 穎，范叢叢，蘇曉娜，沈玉棟，譚 庶，鐘翠麗，許小炫，曾道平，楊金易,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮 527499）

獸藥在防治動物疾病、提高生產效率、改善畜產品質量等方面起著十分重要的作用，但部分養殖人員在養殖過程濫用獸藥，甚至使用違禁藥物、假劣藥物，造成了嚴重的獸藥殘留問題[1-5]。動物性食物獸藥殘留在人體內不斷的蓄積會引起人體的多種急慢性反應，如萊克多巴胺（ractopamine，RAC）和氯霉素（chloramphenicol，CAP）對人體有毒副作用，鹽酸克侖特羅（clenbuterol，CL）有致癌風險，氟苯尼考（florfenicol，FF）具有一定的免疫毒性和胚胎毒性[6-10]。動物源性食品中獸藥的殘留不僅直接危害著人類生命健康，同時也極大危害著畜牧業的發展和生態環境，已引起國際有關組織及許多國家、地區的高度重視。

現階段，根據我國第176號農業部公告，RAC禁止在飼料和動物飲用水中使用；根據我國第235號農業部公告，CL及CAP在動物性食品中不得檢出，FF在豬肉組織中殘留量不得超過300 μg/kg。研究表明，RAC、CL、CAP和FF在豬、牛等動物體內易殘留、消除緩慢，主要經尿液排出體外[11-14]。通過檢測尿液中排出的藥物濃度，可對屠宰前動物體內藥物的殘留情況進行監測，對有效監控食品安全有重要意義。

目前，國內外報道的關于RAC、CL、CAP、FF及其代謝物氟苯尼考胺（florfenicol amine，FFA）的傳統檢測方法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、超高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜法等。這些方法準確度高、穩定性好，被廣泛應用于獸藥殘留檢測[15-22]。但上述方法多數需要配合大儀器，且操作繁瑣、檢測耗時較長、前處理復雜，不適用于快速檢測分析。常用快速檢測方法主要有酶聯免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法、化學發光免疫分析法、膠體金免疫層析（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）法等[23-27]，這些方法或需專業人員操作、或只能檢測單一指標，無法實現獸藥多殘留的簡便快速檢測[28-29]。免疫蛋白芯片測定方法相對于以上各種方法具有低成本、高通量、靈敏度高等優點[30-33]。本實驗利用免疫蛋白芯片技術建立了同時檢測豬尿中RAC、CL、CAP、FF及其代謝物FFA的方法，同時基于智能手機開發了與免疫芯片匹配的檢測應用程序（application，APP），適用于現場大量篩選分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢抗山羊血清、HRP標記羊抗鼠血清、HRP羊抗兔血清 廣州優抗多生物技術有限公司；RAC單克隆抗體、RAC抗原、CL單克隆抗體、CL抗原、CAP單克隆抗體、CAP抗原、FF單克隆抗體、FF抗原 廣東省食品質量安全重點實驗室；RAC（GR，100 mg/瓶）、CL（GR，100 mg/瓶）、CAP（GR，250 mg/瓶）、FF（GR，250 mg/瓶）、FFA（GR，100 mg） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；紫色沉淀型單組分3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液湖州英創生物科技有限公司；P液：含10%蔗糖、0.4%魚明膠、0.5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液；T液：含8%蔗糖、0.4%魚明膠、0.5%酪蛋白的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液；PBST：含0.1% Tween-20的磷酸緩沖液。

1.2 儀器與設備

免疫芯片反應盒 廣東省食品質量安全重點實驗室；硝酸纖維素膜（NC膜） 美國Millipore公司；M227fdw多功能一體機 中國惠普有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫芯片分析方法基本步驟

本免疫芯片測定獸藥殘留的基礎是目標檢測物與抗原競爭抗體的反應。免疫芯片上固定有藥物抗原，檢測時在反應格加入藥物的單克隆抗體和藥物標準溶液或待測樣品，待抗原抗體反應后洗滌，再加入HRP標記二抗，反應后洗滌并加入顯色液，最后通過顯色強度進行藥物定量分析。基本步驟如下：

點樣包被：用碳酸鹽緩沖液（carbonate buffer solution，CBS）稀釋驢抗山羊血清作為質控點樣液備用，稀釋RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原作為檢測點樣液備用。將孔徑為0.22 μm的NC膜裁剪成合適大小，粘貼于PVC板上后置于反應盒中，吸取點樣液按照0.5 cm×0.5 cm的間距點樣，每個樣品點樣量為1 μL。將點樣芯片置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育1 h使蛋白質固定在芯片上。

封閉：包被抗原或抗體后的NC膜上尚有未被抗原或抗體填充的空隙，需對NC膜進行封閉處理，防止非特異性吸附。將上述芯片用PBST洗滌2 次，雙蒸水洗滌1 次，反應格中加入500 μL含1%牛血清蛋白的封閉液，于37 ℃封閉30 min。

一抗孵育：將上述芯片用PBST洗滌2 次，雙蒸水洗滌1 次。反應格中加入T液稀釋的單克隆抗體及標準品溶液或待測樣品液，置于搖床上反應15 min。

二抗孵育：將上述芯片用PBST、雙蒸水各洗滌2 次。反應格中加入200 μL用T液稀釋的HRP標記羊抗鼠、HRP標記羊抗兔混合液，置于搖床上反應15 min。

顯色反應：將上述芯片用PBST、雙蒸水各洗滌2 次。反應格中加入200 μL TMB顯色液，反應3 min，隨后將芯片取出置于潔凈濾紙，風干后用掃描儀掃描，運用Photoshop軟件獲取顯色斑點灰度值進行數據處理分析。

1.3.2 標準曲線與智能手機檢測系統的建立

以確定的最佳工作質量濃度、最佳反應條件制備免疫芯片，以6 個不同質量濃度的藥物標準溶液進行檢測，每個質量濃度重復3 次，使用廣東省食品質量安全重點實驗室開發的智能手機APP“天眼測”獲取芯片顯色斑點灰度值與空白值（CBS點樣）的差值ΔI，以藥物質量濃度（ng/mL）為橫坐標，灰度值差值ΔI作為縱坐標繪制標準曲線。在檢測軟件中添加獸藥殘留檢測項目，導入RAC、CL、CAP、FF獸藥殘留檢測標準曲線。檢測時配合實驗室開發的圖片采集暗箱裝置，運行檢測APP識別芯片顯色斑點，軟件即可顯示獸藥殘留濃度并做出陰陽性判斷。

1.3.3 基于智能手機檢測獸藥多殘留免疫芯片分析方法的驗證評價

選取經HPLC確證未被RAC、CL、CAP及FF污染的20 份豬尿樣品，離心取上清液后向其中分別添加3 種質量濃度的RAC、CL、CAP、FF/FFA藥物標準品，采用基于智能手機免疫芯片的分析方法進行檢測，計算檢測限（limit of detection，LOD），分析其添加回收率與批內、批間變異系數（coefficient of variation，CV）。

1.3.4 與其他快速檢測方法比較實驗

采集30 份豬尿樣品，經前處理后向豬尿中添加不同質量濃度的RAC、CL、CAP、FF/FFA標準品，采用基于智能手機的免疫芯片的分析方法進行檢測，同時與市售膠體金免疫層析檢測卡、ELISA試劑盒檢測進行比較。

2 結果與分析

2.1 NC膜孔徑、點樣液、抗體稀釋液的選擇及反應時間的優化

NC膜固定蛋白質的能力與其孔徑大小相關，對于低分子質量的蛋白，NC膜孔徑越小，膜結合越牢固；點樣稀釋液、抗體稀釋液的選擇影響抗體、抗原在液體中的分散均勻性、顯色效果，從而影響芯片檢測靈敏度；抗原包被時間影響蛋白質固定效果及有效性；顯色反應時間影響顯色效果，反應時間太短則顯色不明顯，反應時間太長易產生背景干擾。

選用孔徑大小分別為0.22、0.45 μm的NC膜作為固定蛋白質的載體制備檢測單種獸藥殘留的免疫蛋白芯片，選用CBS和PBS作為點樣稀釋液稀釋驢抗羊血清與抗原，選用P液、T液、PBS作為抗體稀釋液稀釋單克隆抗體，選擇0.5、1、2、8 h作為包被時間固定蛋白質，選擇1、3、5、10、20 min作為顯色時間進行顯色反應，觀察芯片顯色效果與檢測靈敏度。結果顯示，當使用0.22 μm的NC膜作為蛋白固定載體、CBS作為點樣稀釋液、T液作為抗體稀釋液時，顯色反應后芯片背景干擾較少、點樣斑點形狀較規則、顯色較均勻、靈敏度較高；當包被時間為1 h（37 ℃）時芯片對蛋白固定量最大，斑點顯色最深；顯色反應時間3 min時斑點顯色明顯，背景干擾較少。

2.2 抗原、抗體最佳工作質量濃度的優化

抗原、抗體的工作質量濃度影響芯片顯色效果與檢測靈敏度，隨著點樣抗原與抗體質量濃度的增高，芯片斑點顯色越深，灰度值越高，藥物與抗原競爭抗體的反應越不明顯，靈敏度越低。使用棋盤法優化本實驗中抗原、抗體的最佳工作質量濃度，各抗原、抗體稀釋倍數如表1所示。

表1 各抗原、抗體稀釋倍數的確定Table 1 Determination of optimal dilution factors of coating antigens and monoclonal antibodies

在綜合檢測斑點顯色強度、競爭反應靈敏度、原料用量的基礎上，根據實驗結果最終確定RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原最佳稀釋倍數為1∶1 000、1∶500、1∶2 500、1∶100，RAC抗體、CL抗體、CAP抗體、FF抗體最佳稀釋倍數分別為1∶30 000、1∶400 000、1∶300 000、1∶200 000。在最優反應條件下，免疫芯片對RAC、CL、CAP、FF的檢測靈敏度分別為2、2、0.5、50 ng/mL。免疫芯片檢測不同質量濃度RAC的結果如圖1所示（CL、CAP、FF檢測結果圖類似不再列出）。

圖1 免疫芯片分析RAC殘留的檢測靈敏度Fig. 1 Sensitivity of immunochip assay for RAC

2.3 抗體特異性與交叉反應評價

當4 種檢測項目集成于同一免疫芯片時，4 種檢測對象的抗原-抗體-藥物之間特異性影響檢測結果的準確性。根據間接競爭的原理，對抗原-抗體-藥物之間的特異性進行評價。以確定的最優條件進行實驗，將免疫芯片裁剪成2.5 cm×0.5 cm，吸取質控、檢測點樣液按照5×1（驢抗山羊血清、RAC抗原、CL抗原、CAP抗原、FF抗原）陣式點樣，其余步驟如1.3.1節，其中一抗孵育時1～4號點樣芯片所在反應格中分別加入RAC單克隆抗體、CL單克隆抗體、CAP單克隆抗體、FF單克隆抗體和緩沖溶液，5～8號點樣芯片所在反應格中加入4 種藥物單克隆抗體的混合液及RAC、CL、CAP、FF單種藥物標準溶液。

從圖2a可知，使用包被了驢抗羊血清及多種藥物抗原的免疫芯片進行實驗，當一抗孵育只加入一種單克隆抗體及緩沖液時，只有質控區及該單克隆抗體對應的抗原包被區顯現斑點，其余抗原包被區不顯現斑點，說明該實驗中一種單克隆抗體只與驢抗羊血清及其所對應的抗原產生特異性結合，不與其余3 種藥物抗原發生明顯特異性結合。從圖2b可看出，當一抗孵育只加入混合抗體及單種藥物標準品時，只有該藥物對應檢測區不顯現斑點，說明一種藥物只特異性抑制對應藥物抗原與其單克隆抗體的結合，對其余3 種藥物抗原與其對應抗體的結合無明顯抑制。由此可知，各抗體對其抗原的特異性較好，同時檢測4 種獸藥殘留時各對象的檢測無明顯干擾。

圖2 抗體特異性分析（a）和各分析物交叉反應（b）結果Fig. 2 Evaluation of antibody specificity (a) and cross-reactivities between analytes (b)

2.4 標準曲線的建立

以藥物質量濃度（ng/mL）為橫坐標、灰度值差值ΔI作為縱坐標繪制標準曲線，曲線方程及免疫芯片檢測4 種獸藥殘留的分析參數如表2所示，該方法對RAC、CL、CAP、FF的檢出限（20 份空白樣品平均值與3 倍標準差的和）分別為0.146、0.137、0.035、3.7 3 n g/m L，線性范圍（I C20～I C80）分別為0.35 3 ～1.0 17、0.309～0.897、0.082～0.249、9.424～35.594 ng/mL，相關系數大于0.99。

表2 免疫芯片檢測4 種獸藥殘留的分析參數Table 2 Figures of merit of the immunochip assays for the detection of four veterinary drugs

使用本方法測出FFA的IC50，計算交叉反應率（交叉反應率/%=IC50（FF）/IC50（FFA）×100）。結果顯示IC50（FFA）為22.465 ng/mL，交叉反應率為81.5%。說明該方法可同時檢測FF與FFA。

2.5 基于智能手機檢測獸藥多殘留免疫芯片分析方法的準確度、精密度

使用20 份豬尿樣品進行藥物添加檢測，回收率與CV如表3所示，添加回收率在85.69%～110.66%之間，批內CV不高于12.53%，批間CV小于15%。由此可見，本方法具有良好的回收率，可同時檢測豬尿樣品中RAC、CL、CAP、FF/FFA的殘留量。

表3 豬尿中各藥物回收率和CV值Table 3Recoveries and inter-batch and intra-batch coefficients of variation of four veterinary drugs spiked into pig urine samples

2.6 與其他快速檢測方法比較結果

使用基于智能手機的免疫芯片法、GICA、ELISA法檢測豬尿中RAC、CL、CAP、FF/FFA殘留量，檢測結果如表4所示，免疫芯片法與市售膠體金免疫層析法檢測結果的符合率為99.2%、與ELISA法檢測結果的符合率為98.3%，說明本方法與常用快速檢測方法相比有較高的符合性，可用于現場快速檢測豬尿中RAC、CL、CAP、FF/FFA的殘留量。

表4 免疫芯片法與GICA法、ELISA試劑盒法檢測結果對比Table 4 Comparison of results of detection using immunochip assay,GICA and ELISA

3 結 論

本實驗研制了基于智能手機檢測多種獸藥的免疫芯片，能同時檢測豬尿中RAC、CL、CAP、FF及其代謝物FFA。該方法對RAC、CL、CAP、FF的檢出限分別為0.146、0.137、0.035、3.73 ng/mL，線性范圍分別為0.353～1.017、0.309～0.897、0.082～0.249、9.424～35.594 ng/mL。豬尿中藥物添加回收率為85.69%～110.66%，批內CV不高于12.53%，批間CV小于15%，與GICA和ELISA兩種傳統快速檢測方法相比檢測符合率大于98%，是一種方便快速、高通量、低成本檢測多種獸藥殘留的方法，適用于現場大量篩選分析。