基于iTRAQ 技術分析牛初乳與常乳乳清差異蛋白質組

鄧 微，李韞同，李墨翰，曹雪妍，鄭 艷，武俊瑞，岳喜慶，楊 梅

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

牛乳中含有豐富的營養物質，包括人體所需的蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質等成分，是人類膳食中非常重要的部分。牛乳除了能夠為人體提供足夠的營養成分，還會供給生物活性物質，這些生物活性物質具有提高人體免疫力、調節胃腸道健康以及抵抗病毒等作用[1]。牛初乳中含有豐富的免疫活性物質以及非特異性抗菌物質，對新生兒至關重要，能夠為其提供抵抗感染的防御能力[2-3]、促進胃腸道組織生長發育以及存進機體功能成熟[4]的作用，具有“免疫之王”和“乳黃金”之稱。

蛋白質是牛乳中最主要的成分之一，大約占牛乳的3.5%，而乳脂肪球膜蛋白、酪蛋白、乳清蛋白是牛乳蛋白的主要成分，其中乳清蛋白占牛乳總蛋白的20%左右。乳清蛋白具有較高的營養價值，相對于酪蛋白，乳清蛋白更容易被人體消化吸收，是人體所需的優質蛋白質補充劑[5-6]。乳清蛋白含有豐富的免疫球蛋白、乳鐵蛋白以及一些小分子活性肽，因此被廣泛應用在嬰幼兒乳制品、功能性食品以及特需食品中[7-10]。近年來關于牛乳乳清蛋白的研究更是越來越多，研究者們利用先進的蛋白質組學技術，闡明了不同乳源乳清蛋白質組成，并找到了差異表達蛋白[11-13]。對于乳制品工業而言，牛乳產量大、應用廣，是目前生產乳制品最主要的原料之一，因此發現其中重要的功能活性成分，并應用到乳制品中，具有重要意義。近年來，隨著科學技術的不斷發展，大規模的蛋白質定量技術不斷應用在乳制品中，并得了一些進展[14-18]，然而，大規模的不同泌乳期牛乳的定量蛋白質組學研究還鮮有報道。

本研究利用同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白質組學技術，探究了牛初乳與牛常乳乳清蛋白豐度差異，利用生物信息學方法，分析了牛初乳與牛常乳乳清豐度差異蛋白的功能，為生產和提高牛乳產品品質、研發嬰幼兒乳粉及功能性食品的生產提供重要信息和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳來自于沈陽輝山乳業牧場，為了確保實驗的準確性，樣品選自年齡均為1～3 歲之間健康的黑白花奶牛，飼養與管理條件均一致。初乳（0～3 d）、常乳（1～6 個月）的樣品各采集自60 頭奶牛。采集后的樣品立即放入冰盒中運送至實驗室，并在超低溫冰箱中-80 ℃貯藏備用。實驗前，將牛初乳與牛常乳分別混合，其目的為排除個體性差異。

二硫蘇糖醇（dithiotheritol，DTT）、十二烷基硫酸鈉、尿素、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris） 美國Bio-Rad公司；測序級胰蛋白酶、iTRAQ 8標試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒、色譜級甲酸、色譜級乙腈、30 kDa超濾離心管 美國Sigma公司；C18固相萃取小柱美國Waters公司；鹽酸、氯化鈣、氯化鈉（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher公司；微量移液器、真空離心濃縮儀、5910R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；AKTA Purifier 100純化儀美國GE Healthcare公司；WFZ UV-2100可見-紫外分光光度計 美國尤尼柯公司；Milli-Q超純水系統 賽多利斯集團公司；真空冷凍干燥機 磐豐干燥設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳乳清蛋白的制備

樣品于-80 ℃冰箱取出，4 ℃溶解。各取50 mL樣品于離心管中，在4 ℃、8 000×g離心20 min。小心移去上次乳脂肪，剩余的脫脂乳置于新的離心管中，加入10 mL的PBS清洗3 次，每次超聲1 次（60 W，20 s），4 ℃、80 000×g離心60 min，收集下層脫脂乳樣品。中層和下層樣品繼續4 ℃、120 000×g離心60 min，收集上清乳清樣品。加入5 倍體積的預冷丙酮，充分溶解，-18 ℃冷卻過夜。并于4 ℃、100 000×g離心20 min，收集蛋白質沉淀，此步驟重復3 次，得到乳清蛋白，利用Bradford試劑盒測定乳清蛋白含量[19]。

1.3.2 牛乳乳清蛋白的胰蛋白酶酶解及iTRAQ標記

根據牛乳乳清蛋白質濃度測定結果，分別取樣品（牛初乳、牛常乳）提取的乳清蛋白500 μg，向樣品中加入一定量的緩沖液A（0.1 mol/L NH4HCO3、pH 8.0 0.1 mol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素），加入DTT將終濃度調整為10 mmol/L，并與37 ℃條件下，孵育120 min，反應結束后冷卻至室溫。向混合溶液中加入IAA調整濃度為50 mmol/L，避光反應45 min。加入一定量的水，將B緩沖液A的濃度稀釋至1.5 mol/L，按照1∶50的比例添加測序級胰蛋白酶，并于37 ℃條件下反應20 h，最終牛乳乳清蛋白酶解液利用C18進行脫鹽處理，并與OD280nm肽段進行定量[20]。取200 μg的乳清蛋白酶解肽段，利用iTRAQ試劑盒進行標記，標記后的肽段在室溫下孵育60 min。

1.3.3 毛細管高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定

每份樣品采用nL流速HPLC液相系統進行牛乳乳清蛋白肽段分離。緩沖液：A液選擇0.1%甲酸溶液，B 液選擇0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈的質量分數為84%）。色譜柱以95%的A液平衡。樣品由自動進樣器上樣到C18（2 cm×100 μm，5 μm），再經分析柱C18（75 μm×100 mm，3 μm）分離，流速控制為300 nL/min。梯度洗脫程序：0～50 min，96%～50% A，4%～50% B；50～54 min，50%～0% A，50%～100% B；54～60 min，0% A，100% B。

每份牛乳乳清蛋白標記肽樣品經毛細管HPLC分離后利用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。分析時長為60 min，利用+離子檢測，母離子掃描范圍控制在m/z300～1 800。質譜分析原始數據存為RAW文件，用軟件Mascot 2.2結合Proteome Discoverer 1.4進行查庫鑒定及牛乳乳清蛋白酶解肽段定量分析。原始文件用Proteomics Tools分析軟件抽提肽段報告離子峰定量信息，并以牛初乳組為內參對信號強度進行歸一化分析處理，以軟件計算的各肽段比值的加權平均值作為蛋白質定量結果。查庫時將儲存的RAW文件利用Proteome Discoverer軟件提交至Mascot 2.2服務器，選擇已經建立好的數據庫，然后進行數據庫搜索。利用Proteome Discoverer 1.4軟件對牛乳乳清蛋白酶解肽段報告離子峰的強度值進行定量分析[21]。

1.4 牛乳乳清蛋白的生物信息學分析

為確定蛋白的功能，利用在線DAVID在線數據分析軟件進行蛋白數據庫檢索（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），分析乳清豐度差異蛋白的基因功能注釋（gene ontology，GO）和關鍵詞。利用STRING分析軟件（https://string-db.org/）探究不同泌乳期牛乳乳清豐度差異蛋白之間的互作網絡。

2 結果與分析

2.1 牛乳乳清質譜鑒定

將iTRAQ標記后牛初乳、牛常乳乳清蛋白酶解混合肽段進行強陽離子柱分離，為保證鑒定蛋白數量，采用分級的方式進行收集肽段，結果如圖1所示。

圖1 牛乳乳清蛋白酶解肽段SCX色譜圖Fig. 1 SCX chromatogram of peptides derived from enzymatic hydrolysis of milk whey proteins

牛乳乳清蛋白酶解肽段利用SCX分級并進行脫鹽后的樣品利用質譜分析，然后數據利用Mascot查庫。結果合并后根據Peptide FDR≤0.01進行篩選過濾。最終鑒定到2 810 個肽段，通過對比數據庫，在不同泌乳期牛乳乳清中共鑒定到599 種蛋白，其中在牛初乳與牛常乳中找到60 種乳清豐度差異蛋白（P＜0.05），如圖2所示。雖然牛常乳與牛常乳乳清蛋白具有一定的相似性，但是在豐度上存在一定的差異。Golinelli等[22]利用2-DE在初乳中鑒定到20 個點，在牛常乳中鑒定到18 個點。Yang Mei等[23]利用iTRAQ研究了人乳與牛乳差異表達乳清蛋白，并找到了乳清蛋白的功能差異。Senda等[24]利用2-DE技術在牛乳乳清中鑒定到25 種蛋白。Yang Yongxin等[25]利用iTRAQ標記的方法在人常乳與牛常乳中鑒定到了211 種乳清蛋白，并找到了133 種差異表達蛋白。Le等[26]利用蛋白質組學技術在牛初乳乳清中鑒定到253 種蛋白，在牛常乳乳清中鑒定到257 種蛋白。對比之前的研究，本實驗鑒定到了更多的牛乳乳清蛋白并獲得了更多的定量信息，這些蛋白可能是牛乳乳清中重要的生物活性成分。

圖2 牛初乳與常乳乳清差異表達蛋白熱圖Fig. 2 Hierarchical clustering heat map of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

在這些豐度差異蛋白中，與牛常乳相比，在牛初乳中存在25 種上調表達蛋白，35 種下調表達蛋白。這些不同泌乳期牛乳乳清差異蛋白中，糖基化依賴性細胞黏附分子1（登錄號：P80195）、α-乳白蛋白（登錄號：Q9TSR4）、乳過氧化物酶（登錄號：A5JUY8）、蛋白激酶c結合蛋白NELL2（登錄號：H0YI34）、基質依賴磷酸鹽運輸蛋白2B（登錄號：F1N6D4）在牛常乳中均表現出高表達水平（牛常乳乳清蛋白表達量均大于牛初乳乳清蛋白的5 倍以上）。這些高豐度的牛常乳乳清蛋白的發現能夠為以牛乳清蛋白為基料生產功能性食品及特需食品提供理論依據。免疫球蛋白IgG輕鏈（登錄號：Q6GMX4）、MHC I類抗原（登錄號：Q860J9）、Ig重鏈的可變區（登錄號：A2P2H9）、肌萎縮蛋白1（登錄號：A0A024R2W4）、Igλ-1 C鏈（登錄號：L8IAF4）在牛初乳乳清蛋白中均表現出高表達水平（牛初乳乳清蛋白表達量均大于牛常乳乳清蛋白的5 倍以上）。這些牛初乳乳清高表達量蛋白主要是與免疫相關的蛋白。牛初乳中高表達量蛋白的發現能夠為嬰幼兒配方乳粉的生產以及功能性食品提供重要信息。

2.2 乳清豐度差異蛋白的GO功能注釋分析

GO功能注釋包括生物過程、分子功能及分子組成。本研究將牛初乳與牛常乳乳清豐度差異蛋白進行GO功能注釋進行分析，結果如圖3所示。

圖3 牛初乳與牛常乳乳清差異表達蛋白的GO功能注釋Fig. 3 GO annotation of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

通過牛初乳與牛常乳乳清豐度差異蛋白的GO功能注釋分析可知，乳清差異蛋白主要參與的生物過程為轉運、定位、單一生物作用、生物質量調節、以及紙質轉運與定位；主要參與的分子功能為頂端質膜、細胞外區域、細胞外區域部分、細胞外區域空間以及膜結合細胞器；主要參與的細胞組成為蛋白結合和陰離子結合。將差異蛋白通過GO功能注釋能夠進一步了解這些差異蛋白的功能作用。牛初乳與牛常乳乳清差異蛋白在機體中豐度的上調與下調均會影響到一些生物調控作用。Liao等[27]利用GO功能注釋分析了不同泌乳期人乳乳清差異蛋白主要參與了信號傳導、細胞外組成、代謝等過程。Yang Yongxin等[28]利用iTRAQ技術分析了不同物種牛乳、駱駝乳、羊乳、水牛乳的乳清差異蛋白，并將差異蛋白利用GO功能注釋進行分析，結果發現，不同哺乳動物乳乳清豐度差異蛋白主要參與的生物過程為生物調節；主要參與的分子功能為蛋白結合；參與細胞組成為細胞內部分。因此，找到這些差異表達蛋白對深入認識牛初乳與牛常乳乳清蛋白具有重要作用，為日后生產特定功能的乳清蛋白制品提供重要理論依據。

2.3 乳清豐度差異蛋白分析

圖4 牛初乳與牛常乳乳清蛋白關鍵詞Fig. 4 Key words about bovine whey proteins in bovine colostrum and mature milk

表1 牛初乳與牛常乳乳清與信號傳導相關的豐度差異蛋白Table 1 Signal transduction-related differential abundant whey proteins between bovine colostrum and mature milk

表2 牛初乳與牛常乳乳清糖基化豐度差異蛋白Table 2 Differential abundant glycoproteins between bovine colostrum and mature milk

由圖4可知，牛初乳與牛常乳乳清差異表達蛋白中有9 種蛋白與信號傳導有關、6 種糖基化蛋白、5 種分泌型蛋白、5 種具有二硫鍵蛋白、2 種溶酶體蛋白以及2 種為免疫球蛋白結構域。表1為不同泌乳期牛乳乳清與信號傳導相關的豐度差異蛋白，在信號傳導相關差異蛋白中，有3 種蛋白在牛初乳乳清中豐度上調，6 種蛋白豐度下調。信號傳導蛋白在機體內與代謝途徑相關，因此，這些蛋白豐度的上調或者下調均會影響機體的生物反應[29]。表2為牛初乳與牛常乳乳清差異表達糖基化蛋白，在這些糖基化差異蛋白均在牛常乳中豐度上調。并且，附睪分泌蛋白E1、糖基化依賴性細胞黏附分子1、上皮黏蛋白、前列腺素蛋白還與信號傳導相關，這些蛋白可能在機體中具有重要的生物學功能。這也說明，一種蛋白在機體內具有多重作用與功能。Cao Xueyan等[30-32]利用蛋白質組學技術研究了人乳與牛乳乳脂肪球膜、乳清中糖基化位點的差異，找到了牛乳中糖基化蛋白，并分析了這些糖基化蛋白的功能。本研究通過對牛初乳、牛常乳乳清差異豐度蛋白的關鍵詞進行了分析，發現了與重要生物學功能相關的蛋白，這些蛋白有的在牛初乳中豐度上調，有的在牛初乳中豐度上調。因此，這些具有重要生物學功能蛋白的發現，能夠為功能性食品及乳制品的生產與研發提供重要信息。

2.4 乳清豐度差異蛋白的蛋白質網絡互作分析

在機體中，蛋白質與蛋白質之間的結合作用以及相互作用是蛋白質彼此之間傳遞信號和相互調節行使其功能與作用的基礎。因此，本研究將牛初乳、牛常乳乳清豐度差異蛋白進行蛋白質網絡互作分析，對于揭示牛乳乳清蛋白質的生物學功能并找到具有關鍵蛋白具有重要意義，結果如圖5所示。在60 種牛初乳與牛常乳乳清差異表達蛋白中，有14 種蛋白在String數據庫中被收錄，通過分析發現有10 種蛋白的17 種相互作用。其中，具有高連接度的為黃嘌呤脫氫酶/氧化酶、免疫球蛋白λ樣多肽1。黃嘌呤氧化酶的功能主要是參與機體內核酸的分解代謝以及促進鐵的吸收與轉運[33]。免疫球蛋白λ樣多肽1主要會影響機體對乳脂的合成代謝[34]。因此，這些高連接度的牛乳乳清差異蛋白很可能是調節整個系統代謝和信號轉導途徑的關鍵節點，具有非常重要的作用。

圖5 牛初乳與牛常乳乳清差異蛋白的蛋白質互作網絡Fig. 5 Protein-protein interaction networks of differentially expressed whey proteins between bovine colostrum and mature milk

3 結 論

本研究利用iTRAQ蛋白質組學先進技術，對牛初乳、牛常乳乳清蛋白的組成及豐度差異進行了鑒定與分析。在599 種鑒定的具有定量信息的乳清蛋白中，發現了60 種差異豐度乳清蛋白。與牛常乳相比，牛初乳中存在25 種豐度上調表達蛋白，35 種豐度下調表達蛋白，說明牛初乳與牛常乳在蛋白質豐度上存在較大差異。通過GO功能注釋、功能關鍵詞、蛋白質網絡互作等生物信息學分析發現，差異蛋白主要參與的生物過程為轉運；主要參與的分子功能為頂端質膜；主要參與的細胞組成為蛋白結合。并找到了9 種與信號傳導有關的乳清差異蛋白，以及具有高連接度的黃嘌呤氧化酶與免疫球蛋白λ樣多肽1。本研究對牛初乳與常乳乳清蛋白豐度的差異進行了深入研究，找到了重要的功能性蛋白，這些蛋白的發現能夠為日后生產及優化功能性乳制品提供理論依據。