成熟度對諾麗果酵素品質的影響

趙文珂，肖春琴，張 賢，崔 春,*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.海南赤酵生物科技有限公司，海南 海口 570100）

諾麗果是海巴戟天的果實，屬呼吸躍變型水果[1]。果實呈手榴彈狀，表面上有凹凸不平的麻點，成熟過程顏色從青色變成黃色直至接近白色，果肉豐富多汁，較為苦澀。成熟的諾麗果實具有一種獨特的強烈腐臭味道[2]，果肉呈凝膠狀。諾麗果含有至少200 種植物化學物質和100 種揮發性化合物[3]，具有多種生理活性，營養價值極高[4]。研究證實諾麗果具有抗氧化[5-6]、防癌抗腫瘤[7-9]、消炎抑菌[10]、降血糖和保護肝臟[11]、抗胃潰瘍和食道炎[12]、調節五羥色胺和多巴胺[13]、抑制血管增生[14]、抑制脂蛋白酶[15]等多種生理功能。

目前市面上很多和諾麗果有關的產品都是沿用就地發酵這種傳統處理方法，即將成熟的諾麗果置于室溫下進行密閉發酵，利用諾麗果果實內原生菌進行發酵而得到酵素。諾麗果果內菌主要包含細菌、酵母菌和霉菌，其中細菌占比最高，霉菌數量最少[16]。諾麗果經過發酵后得到的諾麗果酵素含有豐富的VC、VB1、VB2、VB3和VB12等[17]，而且發酵后的酵素能有效增加有益微生物體（酶、酵母和菌類等）的數量和質量，從而增強有效成份的生物活性。因此，發酵后的諾麗果酵素比不發酵的諾麗果功效更強[18]。

對諾麗果發酵的研究均是以成熟的黃色諾麗果或者乳白色諾麗果為原料，鮮見成熟度對諾麗果酵素品質影響的相關研究。諾麗果成熟過程中品質和生理活性均發生較明顯變化[19]，因此，本研究探究諾麗果成熟度對發酵諾麗果酵素品質的影響，以期為高品質諾麗果生產提供理論和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未成熟的諾麗鮮果（即青色諾麗果）以及成熟的諾麗鮮果（即黃色諾麗果）從海南當地現采摘寄送至實驗室。

酪氨酸酶（500 IU/mg）、左旋多巴 上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸、福林-酚、異辛烷、醋酸銅（均為分析純）、胰脂肪酶（15～35 IU/mg）上海阿拉丁試劑公司；平板計數瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（均為生化試劑） 廣東環凱微生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME204E分析天平 梅特勒-托力多儀器（上海）有限公司；SPECTRA MAX 190酶標儀 Molecular Devices公司；GL21M高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；0～80手持式折光儀 禹城市田園信科光學儀器有限公司；UV765紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；ZXJP-A1430霉菌培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；FJ200-SH數顯高速分散均質機 上海標本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 諾麗果酵素的制備

取新鮮的諾麗果用蒸餾水洗凈表面，瀝干后切成小塊，置于密封發酵罐中，于室溫條件下避光自然發酵，定期從發酵罐中取諾麗果浸出酵素并保存在-4 ℃冰箱，以備檢測使用。

1.3.2 諾麗果發酵過程中理化指標的測定

pH值和總酸檢測參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]；可溶性固形物測定參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[21]；還原糖測定采用3,5-二硝基水楊酸法[22]；總糖測定采用蒽酮-硫酸法[23]；總多酚測定采用福林-酚法[24]；氨基酸態氮測定采用甲醛滴定法[25]。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測定改良自鄰苯三酚自氧化法[26]。具體步驟如下：取4.5 mL TE緩沖液和10 μL鄰苯三酚溶液混合均勻，立即在波長325 nm處測定吸光度，記為A自0，在2 min之內，每隔30 s記錄一次，共記錄4 個值分別為A自1、A自2、A自3、A自4，最后計算A自值。取4.5 mL TE緩沖液和10 μL諾麗果酵素，振蕩均勻后加入10 μL鄰苯三酚溶液，混勻后快速在325 nm波長處測定吸光度，記為A抗0，在2 min內每間隔30 s測定一次，分別記為A抗1、A抗2、A抗3、A抗4，并計算出最終的A抗值。SOD活力計算如式（1）所示：

1.3.3 諾麗果發酵過程中菌落總數、霉菌和酵母菌的測定

菌落總數測定參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[27]；霉菌和酵母菌測定參考GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》[28]。

1.3.4 諾麗果發酵過程中酪氨酸酶抑制率和胰脂肪酶抑制率的測定

酪氨酸酶抑制率測定采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法[29]。反應混合物2 mL（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液1.8 mL（pH 6.8）+諾麗果酵素0.1 mL+蘑菇酪氨酸酶0.1 mL（40 U）），37 ℃孵育10 min，加入0.15%左旋多巴反應液1 mL，2 min后立即于波長475 nm處測定吸光度。酪氨酸酶抑制率計算如式（2）所示：

式中：A為未加諾麗果酵素的加酶混合液的吸光度；B為未加諾麗果酵素也未加酶的混合液的吸光度；C為加諾麗果酵素和酶混合液的吸光度；D為加諾麗果酵素而未加酶的混合液吸光度。

胰脂肪酶抑制率測定參考周麗麗[30]的方法。在25 mL比色管中加入2 mL乳化液以及2.5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），40 ℃預熱5 min，再加入1 mL樣品以及0.5 mL 3 mg/mL的胰脂肪酶溶液，40 ℃水浴反應20 min，加入6 mL無水乙醇以及1 mL 6 mol/L HCl溶液使反應停止，再加入3 mL異辛烷在60 ℃水浴中靜置分層10 min，冷卻后取上層液體1 mL于離心管中，再加入4 mL異辛烷以及1 mL醋酸銅顯色劑，振蕩后靜置，取上層清液在714 nm波長處測定吸光度。將樣品替換成蒸餾水作為空白對照組，其余實驗操作步驟不變。胰脂肪酶抑制率如式（3）所示：

式中：A空為空白對照組的吸光度；A樣為實驗組的吸光度。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3 次，使用SPSS 16.0對數據進行統計學處理，所有數據以表示，并使用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 諾麗果發酵過程中酪氨酸酶抑制率、胰脂肪酶抑制率的變化

表1 成熟度對諾麗果發酵過程中酪氨酸抑制率的影響Table 1 Effect of maturity on tyrosinase inhibition rate during fermentation of noni fruit%

酪氨酸酶是人體內存在的一種具有雙重催化功能的重要生物酶，對人體的黑色素形成具有關鍵作用[31]，因此，酪氨酸酶抑制活性可表征諾麗果酵素的美白活力。由表1可得，隨著發酵時間的延長，青果和黃果酵素的酪氨酸酶抑制率均呈上升趨勢。青果酵素經過8 周發酵后，酪氨酸酶抑制率可達到89.62%，遠高于黃果酵素的58.65%。這表明諾麗果青果酵素具有更好的美白效果。

表2 成熟度對諾麗果發酵過程中胰脂肪酶抑制率的影響Table 2 Effect of maturity on the inhibition rate of pancreatic lipase during fermentation of noni fruit%

食物中的脂肪被胰脂肪酶水解為單酰甘油和游離脂肪酸后在腸道被吸收，然后在體內重新合成脂肪，是導致肥胖等諸多疾病的重要原因之一[32]。脂肪酶抑制活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，有控制體重的作用。由表2可知，由未成熟青色諾麗果發酵得到的酵素在整個發酵過程中均具有較高的胰脂肪酶抑制作用，發酵第1、4、8周的胰脂肪酶抑制率均在85%以上；而黃果在發酵第1周沒有胰脂肪酶抑制效果，但是隨著發酵時間的延長，其胰脂肪酶抑制率不斷提高，發酵至第8周其胰脂肪酶抑制率高達84.5%，與青果酵素相當。這表明青果酵素在整個發酵過程中均具有潛在的預防肥胖的功效，而黃果酵素在發酵后期具有良好的防止肥胖的效果。

2.2 諾麗果發酵過程中總多酚、SOD活力、還原糖和總糖的變化規律

圖1 成熟度對諾麗果發酵過程中總多酚（A）和SOD活力（B）的影響規律Fig. 1 Effect of maturity on total polyphenol content (A) and SOD activity (B) during fermentation of noni fruit

如圖1A所示，青果和黃果發酵過程中總多酚含量隨著發酵時間的延長呈現下降趨勢（P＜0.05），黃果發酵過程中的總多酚含量高于青果酵素（P＜0.05）。由圖1B可知，SOD活力隨著發酵時間的延長也呈現下降趨勢，在發酵后期酵素基本上檢測不到SOD活力。青果和黃果SOD活力的下降無明顯差異。通過總多酚以及SOD活力的變化趨勢推測，長時間的發酵使得諾麗果酵素抗氧化能力下降。

如圖2所示，黃果酵素的總糖與還原糖含量在發酵過程中呈現浮動趨勢。總糖質量濃度在26～40 mg/mL范圍內，隨著發酵時間的延長有顯著差異。郝玉潔等[33]在諾麗果控溫37 ℃發酵過程中測得100 d內總糖質量濃度在45～50 mg/mL范圍波動，本研究結果與其相符。而青果酵素的總糖和還原糖含量隨著發酵時間的延長而逐漸減少（P＜0.05），與下述可溶性固形物的變化趨勢對應。總糖和還原糖含量的變化趨勢與發酵過程中纖維素、果膠等大分子碳水化合物被酶和微生物等分解產生低分子糖類，以及微生物生長消耗糖類物質的動態變化有關，青果酵素的糖量變化與黃果酵素趨勢不同，推測原因是青果發酵過程中微生物數量遠超黃果酵素，所以消耗糖量的速度極快。

圖2 成熟度對諾麗果發酵過程中總糖（A）和還原糖（B）的影響Fig. 2 Effect of maturity on total sugar (A) and reducing sugar (B)contents during noni fruit fermentation

2.3 諾麗果發酵過程中菌落總數、霉菌和酵母菌的變化

圖3 成熟度對諾麗果發酵過程中菌落總數（A）和霉菌（B）、酵母菌（C）的影響規律Fig. 3 Effect of maturity on total number of colonies (A), mold count (B)and yeast count (C) during fermentation of noni fruit

由圖3可知，諾麗果在發酵初期的菌落總數高于發酵后期，則諾麗果進行發酵后的菌落總數減少，說明諾麗果發酵過程中在一定程度上抑制了微生物的生長，起到了抑菌的作用。其中，在發酵至第3～4周諾麗果酵素的菌落總數呈現出低峰狀態，微生物數量的減少推測原因可能是由諾麗果酵素的化學變化引起，原因有二：一是底物特征發生改變；二是諾麗果本身的抑菌性開始起作用，此時的抑菌效果最好。青果酵素的菌落總數遠超過黃果酵素（P＜0.05），數量級上的差距說明利用未成熟諾麗果進行發酵所得酵素對微生物的抑制作用不明顯，其抑菌效果遠低于利用完全成熟諾麗果酵素。青果與黃果的含糖量表現出明顯不同，推測可能因為青果的菌落總數遠高于黃果，導致青果酵素的總糖含量和還原糖含量低于黃果酵素，且呈急速下降趨勢。

諾麗果酵素的霉菌在發酵過程中的總體變化趨勢與菌落總數一致，從第2周開始，霉菌數量下降，后續發酵過程霉菌數量略有增加（P＞0.05）。黃果酵素的酵母菌僅在第3周發酵液中檢測到，其余發酵時間未檢測到。青果酵素的霉菌和酵母菌數顯著高于黃果酵素，這與菌落總數的實驗結果相符。說明利用成熟諾麗果進行發酵所得的酵素抑制霉菌和酵母菌的能力遠大于未成熟諾麗果酵素，Dittmar[34]于1993年得出諾麗果的成熟程度與加工方式影響其抗菌性，其成熟諾麗果的抗菌性優于未成熟諾麗果，本實驗佐證其觀點，推測諾麗果在成熟過程中合成了某種具有抑菌性的物質，并且在發酵過程中能夠保留下來。

2.4 諾麗果發酵過程中理化指標的變化

圖4 成熟度對諾麗果發酵過程中pH值（A）和總酸（B）的影響Fig. 4 Effect of maturity on pH (A) and total acid content (B) during fermentation of noni fruit

工業和信息化部于2018年12月21日頒布了酵素行業標準QB/T 5323—2018《植物酵素》[35]，酵素品質有了規范可循。標準規定食用植物酵素的pH≤4.5、總酸≥0.8 g/100 g。如圖4A所示，青果和黃果酵素的pH值隨著發酵時間的延長呈現下降趨勢（P＞0.05），在發酵過程中青果酵素的pH值高于黃果酵素（P＜0.05），且pH值符合QB/T 5323—2018的要求，同時與郝玉潔等[33]在研究諾麗果在37 ℃控溫發酵過程中pH值從3.9緩慢下降至3.6結果相符。如圖4B所示，青果酵素和黃果酵素的初始總酸含量水平相當，隨著發酵時間的延長，總酸含量均有所增加（P＞0.05），但增長幅度不同。黃果酵素總酸含量經過發酵有微量增加，從0.86 g/100 g緩慢上升至0.93 g/100 g，青果酵素總酸含量的增長速度遠高于黃果酵素，并無顯著性差異，相比于發酵初期總酸含量增加了1 倍。同時兩種酵素在發酵過程中的總酸符合其技術規范。其中青果酵素的pH值不斷下降，總酸不斷上升，推測主要是由于青果酵素中酵母菌含量較高，酵母菌代謝生成的有機酸、二氧化碳等物質積累而成。

圖5 成熟度對諾麗果發酵過程中可溶性固形物（A）和氨基酸態氮（B）的影響規律Fig. 5 Effect of maturity on soluble solids (A) and amino nitrogen (B)contents during fermentation of noni fruit

如圖5A所示，青果在發酵過程中的可溶性固形物不斷減少，從6.3 °Brix下降至4.2 °Brix（P＞0.05），而黃果酵素的可溶性固形物則是呈波動性變化（P＞0.05），穩定在6.0～7.0 °Brix范圍內，原因可能是由于青色諾麗果硬度較大，結構致密。如圖5B所示，諾麗果在發酵初期氨基酸態氮含量下降幅度較大，在后續發酵過程中含量基本保持穩定（P＜0.05），推測可能是由于隨著發酵的進行，氨基酸被菌體利用，導致其氨基酸態氮含量不斷下降，發酵后期由于菌體生長緩慢，氨基酸消耗逐漸變小。

3 結 論

本研究利用未成熟的青色諾麗果和成熟的黃色諾麗果進行發酵，結果表明，黃果酵素的抑菌性優于青果，青果第8周發酵液的酪氨酸酶抑制率和胰脂肪酶抑制率均較高，具有潛在的美白功效和減肥功效。通過總多酚和SOD活力的測定可以得出縮短發酵時間有利于保留更好的抗氧化性。青果和黃果酵素的pH值和總酸均符合植物酵素標準，其中青果酵素的pH值高于黃果酵素，可溶性固形物含量低于黃果酵素。