膠紅酵母與釀酒酵母共發酵對干紅葡萄酒香氣與色澤的影響

馬 娜，王星晨，孔彩琳，陶永勝,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

香氣是葡萄酒感官評價的重要指標，也是影響葡萄酒質量風格的重要因素。品種香氣來源于葡萄果實自身風味前體物質，通常以香氣糖苷的形式存在，發酵過程中由酵母產生的糖苷酶水解釋放。另外，酵母代謝產生的發酵香氣也是構成葡萄酒香氣的主要方面[1]。我國部分葡萄酒產區位于季風氣候區，葡萄成熟期雨熱同季，導致原料常常在達到技術成熟度之前采收。葡萄成熟期香氣糖苷隨果實中糖含量增加減緩而不斷積累[2]。季風性氣候容易導致原料香氣品質降低，酚類物質等積累不足，進而使所釀葡萄酒質量下降。因此，研究季風性氣候產區紅葡萄酒增香釀造提高其風味質量的理論及技術應用手段具有重要意義。

酵母菌因其獨特的代謝活動和發酵特性顯著影響葡萄酒的質量[3]。釀酒酵母具有較高的乙醇轉化率、發酵純凈徹底等優點，在葡萄酒釀造中被廣泛使用[4]。但其單一接種發酵可能使葡萄酒風味同質化，不利于酒的復雜度的形成[5]。近年來，越來越多的研究發現，一些非釀酒酵母對葡萄酒的風味形成具有積極作用[6-7]。與釀酒酵母相比，某些非釀酒酵母具有較高的糖苷酶或酯酶活性，利于水解香氣前體物質，調節酯類生成，從而增強香氣特征[8-10]。大多數非釀酒酵母乙醇耐受性低，為了保證發酵完全且避免產生不良副產物，通常將其與釀酒酵母進行混菌發酵[11]。例如，發酵畢赤酵母與釀酒酵母的混合發酵能夠增加酒中高級醇、乙酸酯以及中鏈脂肪酸的含量[8]。研究發現，非釀酒酵母與釀酒酵母的混菌發酵對葡萄酒的品質影響與所用非釀酒酵母的菌株和發酵策略有關[12]，本實驗室前期篩選獲得一株具有高糖苷酶活性的膠紅酵母菌株（Rhodotorula mucilaginosa）北-29，而目前關于膠紅酵母在紅葡萄酒增香釀造中的應用研究還較少。除香氣外，酚類物質和色澤是決定紅葡萄酒風味質量的關鍵因素。本實驗研究優選酵母不同混合發酵策略對紅葡萄酒香氣和色澤品質的影響效果，通過揭示混菌發酵引起的香氣成分、香氣特征及酚類物質組成的變化，確定理想的酵母接種策略，為季風氣候區紅葡萄酒的增香釀造提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄品種為梅鹿輒（Merlot），于2018年9月采收自陜西省合陽縣西北農林科技大學葡萄試驗示范站，還原糖190.5 g/L，總酸6.5 g/L（以酒石酸計），衛生狀況良好。膠紅酵母菌株北-29為本實驗室優選，由中國典型培養物保藏中心的菌株保藏，編號為M2013660；F33釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）活性干粉 法國Laffort公司。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、亞硫酸溶液（含6% SO2）（均為分析純） 天津化學試劑公司；乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、異丁醇、異戊醇、1-辛醇、里哪醇、β-大馬酮、苯甲醇、苯乙醇（均為色譜純，純度≥97%）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）裝置配有57330-U聯用手柄，DVB/CAR/PDMS萃取纖維（50/30 μm，2 cm） 美國Supelco公司；QP2020氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；DB-WAX毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、Cary-60UV-vis紫外-可見分光光度計 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標

參考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒分析方法》，測定總糖、還原糖、總酸、揮發酸、乙醇體積分數等理化指標。

1.3.2 葡萄酒釀造實驗

酵母接種方案：2 種酵母菌株經酵母浸出粉胨葡萄糖培養基活化擴培接種于葡萄醪中。同時接種：膠紅酵母和釀酒酵母按不同菌數比10∶1（C10∶1）、4∶1（C4∶1）、1∶1（C1∶1）、1∶4（C1∶4）、1∶10（C1∶10）同時接種；順序接種（S1∶1）：提前48 h接種膠紅酵母，然后接種釀酒酵母，2 種酵母的接種比例為1∶1。單位接種量為1×106cells/mL。實驗以釀酒酵母純發酵為對照，每一釀造處理重復2 次。

釀造工藝：篩選成熟衛生的葡萄漿果，除梗破碎，分裝至20 L玻璃罐中，添加50 mg/L SO2混勻，4 ℃低溫浸漬24 h。隨后升溫至20 ℃時，按照上述接種方案在等分后的葡萄醪中接種酵母啟動發酵。控制發酵溫度25～27 ℃，每天監測相對密度和溫度。發酵旺盛期添加蔗糖調整目標酒度到11.5%（V/V）。當相對密度降至1.020時分離皮渣繼續發酵，溫度控制在18～20 ℃。當相對密度低于0.996時，測還原糖含量，低于2 g/L時，添加50 mg/L SO2終止發酵，轉入干凈衛生的10 L玻璃罐中，4 ℃條件下滿罐密封貯存，期間進行幾次倒罐以分離沉淀。酒樣密封貯存6 個月后取樣分析。

1.3.3 多酚及顏色指標測定

1.3.3.1 總酚、黃酮醇、酒石酸酯和花色苷含量

取0.5 mL酒樣，用10%乙醇溶液稀釋10 倍。取0.25 mL稀釋后酒樣，加入0.25 mL 0.1% HCl-95%乙醇溶液和4.55 mL 2%鹽酸-乙醇溶液混勻，室溫靜置15 min。采用10 mm比色皿，測定樣品在280、320、360、520 nm波長處的吸光度。根據沒食子酸（10%乙醇）、槲皮素（95%乙醇）、咖啡酸（10%乙醇）和二甲花翠素-3-葡萄糖苷（10%乙醇）稀釋液在各波長下建立的標準曲線，分別計算出對應總酚（A280nm）、酒石酸酯（A320nm）、黃酮醇（A360nm）、花色苷（A520nm）的含量[13-14]。

1.3.3.2 單體花色苷/輔色花色苷/聚合花色苷比例

調節樣品pH值至3.6，取2 mL酒樣加入20 μL 10%（V/V）乙醛溶液，反應45 min后測定其在520 nm波長處的吸光度A0；用模擬酒稀釋樣品20 倍后測定其在520 nm波長處的吸光度A1；取2 mL酒樣，加入160 μL 50 mg/mL SO2，反應后測定其在520 nm波長處的吸光度A2。吸光度測定前經0.45 μm濾膜過濾，每個處理重復3 次。樣品中各相對比例的計算公式如下[14]：

1.3.3.3 色度和色調

酒樣稀釋10 倍后，經0.45 μm濾膜過濾，利用10 mm光程比色皿測定在420、520、620 nm和700 nm波長處的吸光度[13]。計算公式如下：

1.3.3.4 總單寧[14]

取2 mL稀釋后酒樣（1∶50），加入6 mL 12 mol/L鹽酸，密封避光，沸水浴30 min后迅速冷卻，再加入1 mL無水乙醇，混勻，在550 nm波長處測定吸光度A1；另取2 mL樣品采用相同處理方法，常溫放置30 min，在550 nm波長處測定吸光度A2。

1.3.3.5 鹽酸指數[14]

取2 mL離心管，加入500 μL酒樣、250 μL蒸餾水、750 μL濃鹽酸，搖勻后立即取200 μL混合液，加蒸餾水稀釋，用紫外分光光度計在280 nm波長處測定吸光度A1；另一組采用相同處理，混合均勻后常溫下靜置7 h，離心后去除沉淀，取上清液，加入蒸餾水稀釋，在280 nm波長處測定吸光度A2。

1.3.3.6 乙醇指數[14]

取5 mL離心管，加入0.4 mL酒樣、3.6 mL無水乙醇，混合均勻，用蒸餾水稀釋4 倍，在280 nm波長處測定吸光度A1；另一組采用相同處理，混合均勻后常溫下靜置24 h，離心除去沉淀，取上清液，加入蒸餾水稀釋，在280 nm波長處測定吸光度A2。

1.3.3.7 離子化指數[14]

取稀釋后酒樣，520 nm波長處測定吸光度A1；在酒樣中加入70 mg/mL NaHSO3溶液，在520 nm波長處測定吸光度A2；在酒樣中加入2.8 mL的0.1 mol/L HCl溶液，加入蒸餾水，在520 nm波長處測定吸光度A3；在酒樣中加入2.8 mL的0.1 mol/L HCl溶液，再加入70 mg/mL NaHSO3溶液，在520 nm波長處測定吸光度A4。

1.3.4 香氣成分的儀器分析

供試酒樣的香氣成分采用頂空SPME結合氣相色譜-質譜（headspace-SPME-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用法進行分析，參考Zhu Mengxu等[15]的方法并有改動。

SPME樣品處理：取8 mL酒樣和20 μL內標溶液（40 μg/L 2-辛醇）置于20 mL裝有磁力攪拌子的頂空瓶中，加入2.0 g NaCl，啟動攪拌子，在40 ℃水浴中平衡15 min，然后插入萃取纖維，在40 ℃吸附30 min后立即將萃取頭在GC進樣口熱解吸（230 ℃）5 min。

GC-MS分析條件：不分流進樣，保持載氣（氦氣）恒定流速1.5 mL/min。柱升溫程序為40 ℃保持5 min，以2 ℃/min上升至130 ℃，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，總運行時間78 min。進樣口溫度230 ℃，連接桿溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，電子電離源，在70 eV質譜掃描范圍m/z 35～350。

定性定量分析：采用標準品保留時間對比、保留指數對比和NIST 2017質譜譜庫查詢進行香氣化合物定性。采用內標-標準曲線法定量。通過香氣標準品和2-辛醇的相對峰面積建立標準曲線，R2在0.99以上。將準確定性物質代入標準曲線計算獲得定量結果。

1.3.5 香氣特征的感官分析

感官分析方法具體參照文獻[10]進行。品評小組由培訓良好的葡萄酒專業學生組成。在分析過程中，每一供試酒樣重復分析2 次，將所有酒樣隨機編號，采用隨機區組設計，品嘗員從葡萄酒標準香氣中選擇5～6 個特征詞匯描述樣品香氣特征，并進行量化。最終量化強度值MF（%）由品評小組對某一香氣特征詞匯的使用頻率F（%）和強度平均值I（%）表示。計算公式如下：

MF/%= F×I （10）

1.4 數據分析

不同發酵處理間的數據差異分析采用單因素方差分析（ANOVA），并進行Duncan檢驗、Tukey檢驗的多重比較分析。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）研究不同處理酒樣中香氣成分、酚類物質與顏色指標的分布規律。數據處理運用SPSS 20.0軟件實現。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒的香氣分析

實驗測定了酒樣的重要理化指標，總糖（以葡萄糖計）＜2 g/L，總酸（以酒石酸計）在4.6 g/L左右，揮發酸（以乙酸計）在0.2～0.3 g/L，乙醇體積分數為（11.5±1）%。由于各項理化指標均符合國標（GB 15037—2006《葡萄酒》）要求且處理間差異較小，所以未對結果進行分析討論。經SPME-GC-MS對供試酒樣中香氣成分的定性定量分析，共確定了40 種香氣成分，總量為299～357 mg/L。混合發酵酒樣S1∶1、C10∶1和C4∶1中香氣成分的總含量顯著高于釀酒酵母純發酵酒樣（299 mg/L）。其中，S1∶1酒樣和C10∶1酒樣中香氣成分的總含量分別比對照酒樣高19.4%和16.4%。16 種香氣成分在酒中的濃度與其嗅覺閾值的比值（氣味活性值（odor activity value，OAV））大于1，12 種香氣成分的OAV在0.1～1。

酒樣中共檢測出10 種品種香氣成分，包括4 種萜烯類物質、1 種C13-去甲類異戊二烯化合物、2 種C6化合物、1 種硫醇和2 種酚酸酯。對OAV大于0.1的品種香氣成分含量進行PCA，以揭示不同處理對其整體影響，結果見圖1。PC1和PC2分別占數據總體方差的59.3%和24.7%。C6化合物、硫醇和酚酸酯類香氣物質集中分布于酒樣C4∶1的周圍，位于PC1的正向端上，且與C10∶1酒樣距離較近。里哪醇和β-大馬酮位于PC2的正向端上，距離酒樣C4∶1和S1∶1較近。綜上分析可知，C4∶1、C10∶1處理能夠顯著增加酒樣中C6化合物、硫醇等物質的含量，而S1∶1處理更利于促進萜烯類物質和β-大馬酮的生成。

圖1 前2 個PC上的品種香氣成分的載荷值和酒樣分布Fig. 1 PCA loading plot of PC1 versus PC2 for varietal aroma components and distribution of wine simples

圖2 前2 個PC上的發酵香氣成分的載荷值和酒樣分布Fig. 2 PCA loading plot of PC1 versus PC2 for aroma compounds produced during wine fermentation and distribution of wine samples

發酵香氣成分共檢測出30 種，包括8 種高級醇、13 種酯類物質、5 種脂肪酸和4 種苯乙基類化合物。對OAV大于0.1的發酵香氣成分含量進行PCA，前2 個PC上的發酵香氣成分載荷及酒樣分布見圖2。PC1、PC2分別占數據總體方差的45.3%和27.1%。大部分發酵香氣成分和處理C10∶1、C4∶1及C1∶1分布于PC1的正向端，其中高級醇（1-辛醇、1-壬醇、異戊醇）和中鏈脂肪酸（C6～C12）及其乙酯集中分布，距離酒樣C10∶1最近。乙酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸β-苯乙酯集中分布于PC2的正向端上，距離酒樣C10∶1和S1∶1較近。結合表1數據分析可得，隨著優選膠紅酵母接種比例的升高，混合發酵酒樣中高級醇、中鏈脂肪酸及其乙酯含量增加，而S1∶1處理有利于提高乙酸酯、苯乙基類化合物的含量。

表1 不同混合發酵處理的供試酒樣中香氣成分的SPME-GC-MS定量分析結果Table 1 SPME-GC-MS quantification of aroma compounds in dry red Merlot wines made using different inoculation strategies

供試酒樣香氣特征的感官量化分析結果見圖3。酒樣中5 種香氣特征的MF值較高，且在各處理間存在極顯著差異（P＜0.01）。果香（熱帶水果+甜果+酸果）和漿果類香氣特征中，酒樣C10∶1和C4∶1的MF值最高，其次是S1∶1和C1∶1酒樣。酒樣C10∶1和S1∶1的花香類香氣特征MF值最高。此外，優選酵母高比例接種處理增加了酒樣中動物類（皮革、麝香等）和生青味香氣特征，而在對照酒樣、S1∶1酒樣中對應的MF值較低。分析可得，優選酵母高比例接種處理增強了酒樣的果香和花香，但同時也引入了較強的動物味和生青味。S1∶1處理偏重于增強花香，并能降低不良氣味。

圖3 供試酒樣香氣特征雷達圖Fig. 3 Radar map of aroma characteristics of dry red wines

為進一步揭示不同處理對酒樣色澤的影響，對上述各指標進行PCA。如圖4所示，前2 個PC分別占總方差的65.1%和15.1%。總花色苷、酒石酸酯、黃酮醇等指標和酒樣C4∶1、S1∶1位于第4象限。鹽酸指數、聚合花色苷比例、色度、色調等指標和酒樣C4∶1、C10∶1集中分布于第2象限。輔色花色苷比例距離酒樣C10∶1較近。分析可得，優選酵母接種比例較高的酒樣中，酚類物質、總花色苷含量以及單體花色苷、輔色花色苷比例較高，而隨著接種比例的降低，聚合單寧、聚合花色苷比例、色度、色調等升高。

圖4 前2 個PC上的多酚及顏色指標載荷值及酒樣分布Fig. 4 PCA loading plot for polyphenols and color indices and distribution of wine samples

2.2 葡萄酒的色澤分析

實驗測定了酒樣中13 個多酚與顏色相關指標，結果見表2。除總單寧外，其他參數間均存在顯著或極顯著差異，說明混合發酵處理對酒樣色澤影響效果明顯。

表2 混合發酵梅鹿輒干紅葡萄酒的多酚和顏色指標（n=2）Table 2 Polyphenols and color indices of dry red wines made using different inoculation strategies (n= 2)

3 討 論

本研究中混合發酵顯著影響了葡萄酒中香氣成分的化學輪廓。品種香氣成分決定著葡萄酒的品種和區域典型性，主要有萜烯類、C13-去甲類異戊二烯化合物、C6化合物、硫醇等。萜烯類化合物主要由萜烯糖苷酶解釋放，一些單萜醇如里哪醇、香茅醇等氣味活性較高，賦予葡萄酒花香和柑橘類果香[18]。C13-去甲類異戊二烯是葡萄中類胡蘿卜素的衍生物，閾值非常低，具有重要的呈香潛力[19-20]，其中β-大馬酮帶給葡萄酒花香和甜果香。本研究中，順序接種處理酒樣中萜烯類和β-大馬酮含量最高，顯著高于釀酒酵母純發酵酒樣，優選酵母高比例接種酒樣中次之，可能是由于本株膠紅酵母具有高糖苷酶活性，隨著存活時間、數量的增加而水解了更多的香氣前體物質。C6化合物和硫醇含量隨著優選酵母接種比例的升高而顯著增加，而在順序接種酒樣中較低。C6化合物是破碎葡萄中由多不飽和脂肪酸經酶促氧化形成的初始產物，通常與草本、青草味有關[19]。大多數揮發性硫醇通過酵母酶解非揮發性含硫前體的C—S鍵而釋放[21-22]。這一結果可能與酵母間的相互作用有關。Anfang等[23]的研究發現商業酵母與畢赤酵母分離物以1∶9比例混合發酵顯著提高了酒樣中揮發性硫醇3-巰基己基乙酸酯的含量，但其機理尚不清楚。

發酵香氣成分主要是酵母在乙醇發酵過程中的代謝副產物。高級醇是其中含量最多的一類化合物。有研究表明，葡萄酒中低于300 mg/L的高級醇會帶來令人愉悅的香氣復雜性[24]。本研究中，高級醇含量隨優選酵母接種比例的升高而顯著增加，且總質量濃度低于300 mg/L，除帶給葡萄酒醇香特征外，還可能生成乙酸酯、醛等對香氣貢獻更大的物質。酯類對于大多數酒精飲料的香氣至關重要，是果香和花香感知的主要氣味物質[25]。本研究中順序接種和高比例同時接種處理顯著提高了酒樣中乙酸酯的質量濃度，且遠低于引起不良風味的水平（≥100 mg/L）[26]。而適量濃度的乙酸酯尤其是乙酸異戊酯會增加年輕葡萄酒中的水果香氣[27]。由此推斷，增加的乙酸酯可能給葡萄酒的果香帶來積極貢獻。與其他發酵香氣成分相比，中鏈脂肪酸乙酯閾值更低，揮發性較高，且具有協同作用，賦予酒類甜果、類似香水的特征，能夠顯著影響葡萄酒的風味[28-29]。優選酵母高比例接種處理和順序接種處理均增加了酒樣中鏈脂肪酸乙酯（己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯）的含量。中鏈脂肪酸乙酯的含量很大程度上取決于底物中鏈脂肪酸的含量，較少依賴于酶活[30]。而在上述中鏈脂肪酸乙酯含量較高的酒樣中，對應的中鏈脂肪酸含量也較高。苯乙基類化合物通常具有玫瑰花的香氣特征，Lleixa等[31]用非釀酒酵母Hanseniaspora vineae發酵的馬卡貝澳（Macabeo）葡萄酒果香和花香更突出，分析表明乙酸苯乙酯的含量高于閾值且遠遠高于釀酒酵母純發酵酒樣。本研究中，順序接種處理酒樣中苯乙基類化合物含量最高，尤其是OAV＞1的乙酸β-苯乙酯和苯乙醇。

感官分析表明，高比例同時接種處理和順序接種處理均顯著增加了葡萄酒的果香和花香特征。但高比例接種也會引入較強的生青味和動物味，可能與C6化合物、硫醇等含量明顯增加有關。相反，順序接種處理卻降低了不良氣味。此外，順序接種處理最大程度地提升了花香特征，推測可能與里哪醇、β-大馬酮等高氣味活性物質的大量生成有關。

色澤是評價葡萄酒風味質量的重要指標。酚類物質在一定程度上可以反映出葡萄酒的品質優劣，賦予葡萄酒骨架，穩定顏色，具有抗氧化的能力[32-33]。Behrends等[34]的研究發現不同的發酵策略會產生不同的花色苷圖譜。本研究中優選酵母較高比例接種和順序接種處理酒樣中總花色苷含量、輔色花色苷比例、黃酮醇含量都較高。鹽酸指數表示高聚合單寧的比例。乙醇指數表示與多糖結合的單寧比例。值得注意的是，優選酵母低比例接種（1∶10、1∶4）酒樣中聚合花色苷比例、鹽酸指數、乙醇指數等都較高，說明處理提高了酒樣中成分的聚合化水平，酒樣可能老化較快，需要進一步研究。

總體上，優選膠紅酵母與釀酒酵母的不同混合發酵策略對葡萄酒的風味質量具有差異明顯的影響效果。順序接種處理在顯著增加果香和花香的同時沒有產生不良氣味，并且有助于改善色澤質量，具有較好的增香釀造潛力。