濃香型白酒酒醅中總RNA 提取方法評價

胡曉龍，王康麗，宋麗麗，侯建光，曹振華，吳麗麗，牛廣杰，馬歌麗，趙書民，趙 東

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.河南仰韶酒業有限公司博士后研發基地，河南 澠池 472000；3.河南宋河酒業股份有限公司，河南 鹿邑 477200；4.河南省壽酒有限公司，河南 新鄉 453000；5.河南省酒業協會，河南 鄭州 450000；6.五糧液集團有限公司，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒作為我國優勢傳統發酵食品的典型代表，風格獨特，深受消費者青睞，其產銷量均占中國白酒行業的主導地位[1]。在釀造過程中，酒醅是微生物發酵的主要載體和白酒呈香物質的直接來源，因此，研究酒醅活性微生物菌群的多樣性、代謝特征及相互作用等是闡明濃香型白酒固態發酵機制及風味物質溯源的關鍵環節。

近年來，在RNA水平上進行的宏轉錄組學技術被不斷運用于微生物群落研究，宏轉錄組學是后基因組時代最具代表性的新技術[2]，通過對特定時期、特定環境樣品中所有微生物群落的RNA轉錄本進行大規模測序，可以直接獲得環境中可培養和不可培養的微生物轉錄組信息，能真實地反映出活性微生物狀態及其動態變化[3]。例如，Urich等[4]通過對沙質土壤生態系統中微生物RNA轉錄本的分析得到了許多未被人們發現的基因組序列，且發現有5 種不同的優勢細菌種類發生了變化，并得到了這些細菌的代謝機制變化以作為預測生物體活動的指標。Franzosa等[5]在關聯人體腸道的宏基因組和宏轉錄組分析中，發現有部分微生物可在DNA水平上檢測到但很少具有轉錄活性，且RNA水平功能組成的組間差異明顯強于DNA水平，因此僅鑒定DNA水平上微生物的單獨貢獻（高或低）并不能完全反映它們在群落中的作用。以RNA為基礎的宏轉錄組等分子生物學研究則能幫助更好地了解濃香型白酒發酵過程中活性微生物群落的特征及變化，而提取的總RNA質量好壞對后續的研究結果影響較大。

能否有效去除各種雜質和RNA酶是成功提取高質量RNA的關鍵，目前常見的環境樣品RNA提取方法有Trizol法、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法、異硫氰酸胍法、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法和已商品化的試劑盒法。異硫氰酸胍是強烈的蛋白變性劑，可有效抑制RNA酶的活性[6]，此方法可得到較高產量的總RNA，但耗時長，不適用于大量樣品的提取[7]。Trizol是一種總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取出高總產量的總RNA[8-10]，但需液氮研磨，實驗條件苛刻、成本較高，提取富含多糖和多酚的樣品總RNA時會存在嚴重的污染。CTAB法操作需要預熱，溫度過高會使得RNA酶變得活躍導致RNA降解，同時耗時較長、操作繁瑣[11]。試劑盒法提取RNA雖然方便快捷，可得到高純度的RNA，但產量較低、費用高，且對不同的樣品具有選擇性[12]。SDS法雖然試劑簡單易配制，但其無法抑制內源性RNA酶的活性，在提取過程中RNA降解嚴重，將其與苯酚結合可在抑制RNA酶的同時使蛋白質等變性，再結合玻璃珠物理破碎法，可有效地裂解土壤等環境樣品，用以大量提取總RNA[13-15]。

酒醅中多糖、酚類、鹽類、腐殖質、腐殖酸和代謝色素等雜質大量存在，形成了酒醅復雜的環境結構[16]，所以其總RNA的提取存在一定困難。另外，不同提取方法獲得的微生物群落多樣性及其種類、豐度均不同[17]。目前酒醅總RNA提取可采用Trizol法、月桂酸鈉法[11,18]，然而，有關酒醅總RNA提取方法的比較研究尚鮮見報道。

本研究建立了一種改良的SDS-苯酚法，并從提取成本及耗時、RNA質量濃度和純度、電泳結果、反轉錄效果及高通量測序分析5 個方面比較其與目前常規的4 種RNA提取方法提取濃香型白酒酒醅總RNA的效果，包括試劑盒法、Trizol法、CTAB法和月桂酸鈉法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品取自河南省某知名濃香型白酒企業，發酵時間為7 d和15 d的酒醅樣品各200 g，放入無菌厭氧袋中并作好標記，迅速放于冰盒中運回實驗室，于4 ℃保藏。窖泥護理液（主要為Clostridia綱細菌）來自本實驗室。

SDS 上海百賽生物技術股份有限公司；月桂酸鈉、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、異戊醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、CTAB、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 上海麥克林生化科技有限公司；Trizol、水飽和酚 上海源葉生物科技有限公司；異丙醇、無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司；Tris、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、RNase-Free Water、2×Taq Master Mix 北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 北京北化精細化學品有限責任公司；E.Z.N.A.TMSoil RNA Kit 美國Omega公司；Recombinant DNase I、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 大連TaKaRa公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

MP200A精密電子天平 上海良豐儀器儀表有限公司；C1000溫度梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；TGL-20M高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；Mixer4K微型渦旋混合儀 生工生物工程（上海）股份有限公司；KW-1000DC恒溫水浴鍋、85-2恒溫磁力攪拌器江蘇金壇市中大儀器廠；IMS-40全自動雪花制冰機常熟市雪科電器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海中安醫療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；WD-9403C紫外儀 北京六一生物科技有限公司；NanoDrop2000微量分光光度計賽默飛世爾科技公司；Illumina MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

提取RNA所用的槍頭、離心管、燒杯、玻璃棒等均需用0.1% DEPC溶液浸泡過夜，之后1×105Pa滅菌30 min，烘干備用；電泳槽和制膠用具用3%的H2O2溶液浸泡30 min，再用DEPC溶液沖洗干凈。

1.3 方法

1.3.1 酒醅總RNA的提取方法

1.3.1.1 酒醅預培養

將低溫保存發酵7 d和15 d的酒醅樣品各取出100 g，分別置于無菌厭氧培養袋中，每個樣品均按5%接種量分別添加窖泥護理液，將接種后的培養袋置于恒溫培養箱中，37 ℃培養3 d，以期獲取更多有活性的微生物。

1.3.1.2 SDS-苯酚法

參照趙俊等[19]總RNA提取方法進行改良。1）取7 g酒醅于50 mL離心管中，加入5 mL 1 mol/L的CaCl2溶液和5 mL 5% PVP溶液，渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入10 mL 0.05 mol/L的草酸鈉溶液，用相同的方法離心、棄上清液。2）加入3 顆玻璃珠（d=0.5 cm）和12 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，渦旋振蕩5 min后500 r/min離心5 min，取上清液至新的離心管中，沉淀重復洗滌一次，2 次上清液混合后離心3 min，棄去上清液收集細胞沉淀。3）在得到的細胞沉淀中加入玻璃珠（0.5 mm：0.33 g，0.1 mm：0.17 g）和300 μL SDS提取液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTANa2，10 mmol/L MgCl2，1% SDS，6%水飽和酚，0.1% β-巰基乙醇），最大轉速渦旋振蕩5 min，然后15 000 r/min、4 ℃離心2 min，取上清液至新的離心管中，再重復一次；4）向合并的上清液中加入500 μL水飽和酚（pH 4.5），渦旋混勻后離心2 min，取上清液；再加入500 μL的氯仿-異戊醇（24∶1），用相同的方法混勻、離心、回收上清液。5）上清液加入2 倍體積的PEG-NaCl（30% PEG，1.6 mol/L NaCl）溶液，低溫靜置2 h后15 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液。6）用200 μL 70%乙醇溶液清洗沉淀，最后加入50 μL RNase-free water溶解RNA。

1.3.1.3 試劑盒法

稱取7 g酒醅樣品于50 mL離心管中，用15 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，加入3 顆玻璃珠（d=0.5 cm），渦旋振蕩5 min，然后500 r/min離心5 min，取上清液。沉淀用磷酸鹽緩沖液重復洗滌3 次，離心后收集上清液。全部上清液于9 000 r/min離心3 min，棄去上清液，收集細胞沉淀。對預處理后的酒醅樣品按照E.Z.N.A.TMSoil RNA Kit（Omega）的試劑盒說明書方法進行總RNA提取。

1.3.1.4 Trizol法

本方法與SDS-苯酚法基本相同，不同的是采用Trizol試劑抽提，將步驟3）中的SDS提取液換成Trizol試劑。

1.3.1.5 CTAB法

參照Griffiths等[20]的方法并進行適當調整。首先進行預處理（方法同試劑盒法），然后在預處理后的酒醅樣品中加入0.5 mL CTAB提取液（等體積的磷酸鉀緩沖液與10% CTAB溶液配制）和玻璃珠（0.5 mm：0.33 g，0.1 mm：0.17 g），在FastPrep勻漿儀上以6 m/s的速率破碎45 s；16 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液；加入0.5 mL苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），渦旋混勻，16 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液；上清液加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），渦旋混勻，16 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液；上清液加入2 倍體積PEG-NaCl（30% PEG，1.6 mol/L NaCl），上下顛倒混勻，低溫靜置2 h，18 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清液；加入200 μL 70%乙醇溶液清洗沉淀，16 000×g離心5 min，棄掉液體，并吹干沉淀，加入50 μL RNase-free water溶解RNA，然后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3.1.6 月桂酸鈉法

本方法與SDS-苯酚法基本相同，不同的是采用月桂酸鈉抽提液提取，將步驟3）中的SDS提取液換成月桂酸鈉抽提液（25 份月桂酸鈉緩沖液（0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，0.02 mol/L pH 8.0 EDTANa2，月桂酸鈉10 g/L），15 份Trizol，1.5 份β-巰基乙醇，0.5 份二硫蘇糖醇）[11]。

1.3.2 酒醅總RNA的質量檢測

1.3.2.1 濃度及純度測定

分別吸取利用上述5 種方法所獲得的總RNA樣品各2 μL，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定每個RNA樣品用于表征濃度的260 nm波長處OD值，以及表征樣品純度的OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm比值。

1.3.2.2 瓊脂糖凝膠電泳

取20 mL 1×TAE溶液，加入0.2 g的瓊脂糖粉，加熱至沸騰，室溫冷卻至 50～60 ℃后，加入2 μL Goldview I型核酸染料，倒入制膠槽中冷卻至凝固。每個RNA樣品取5 μL分別與1 μL的6×DNA loading buffer均勻混合，然后將其與Marker分別點樣于瓊脂糖凝膠，于100 V電泳30 min。

1.3.2.3 反轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）驗證

利用Recombinant DNase I除去上述RNA樣品中的DNA，以防止DNA污染導致擴增結果出現偏差。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA，反應操作按照試劑盒說明書進行。

參照Zhang Yuguang等[21]描述的方法，使用細菌通用引物515F和806R、相應的擴增反應體系及條件對上述cDNA進行擴增。擴增完成后對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2.4 高通量測序及數據分析

針對酒醅反轉錄cDNA模板，采用微生物16S rRNA基因的通用引物擴增V3和V4兩個高度可變區。PCR擴增參數：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s；72 ℃終延伸5 min；共進行24 個循環。擴增完畢后將PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切割回收目標產物片段進行純化，再進一步通過電泳檢測PCR產物純化效果。然后使用酶標儀檢測文庫濃度，將文庫定量到10 nmol/L，按Illumina MiSeq儀器使用說明書進行PE250/PE300雙端測序，由MiSeq自帶的MiSeq Control Software讀取序列信息。

對雙端測序得到的正反向reads首先進行兩兩拼接，過濾拼接結果中含有N的序列，保留序列長度大于200 bp的序列。經過質量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列使用VSEARCH（1.9.6）進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類（序列相似性設為97%），比對的16S rRNA參考數據庫為Silva 132。然后利用RDP classifier（Ribosomal Database Program）貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統計每個樣本的群落組成。基于OTU得到分析結果，采用對樣本序列進行隨機抽平的方法，分別計算Shannon指數、Chao1指數等α多樣性指數反映群落的物種豐度和多樣性，再通過層次聚類中的非加權組平均法構建UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）聚類樹，并基于樣本OTU豐度進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 總RNA質量濃度及純度、成本及耗時分析

如表1所示，5 種方法均能提取到酒醅樣品中總RNA，其中試劑盒法提取的總RNA平均質量濃度最高（1 190.8 ng/μL），分別為SDS-苯酚法（647.6 ng/μL）、Trizol法（512 ng/μL）、CTAB法（385.65 ng/μL）和月桂酸鈉法（62.2 ng/μL）的1.84、2.33、19.14 倍和3.09 倍。5 種方法所得總RNA樣品的OD260nm/OD230nm存在較大差異，其中SDS-苯酚法和試劑盒法提取的酒醅總RNA的OD260nm/OD230nm均大于2.0，表明這兩種方法所提取出的酒醅總RNA中多糖、酚類、腐殖酸和有機溶劑等物質的污染較小，純度高[22]。而Trizol法、CTAB法和月桂酸鈉法提取的酒醅總RNA樣品的OD260nm/OD230nm遠小于2.0，其平均值分別為0.29、1.10和0.58，表明這3 種方法所提取的RNA樣品中存在多糖、酚類、腐殖酸或有機溶劑等物質的污染現象，純度較差，尤其是CTAB法所提RNA樣品純度最差，進而會對后續分子實驗（如real-time PCR、RT-PCR及電泳分析等）產生不同程度的干擾。SDS-苯酚法和Trizol法所提取酒醅總RNA的OD260nm/OD280nm均在1.8～2.0之間，表明這兩種方法所提取的RNA樣品中蛋白質污染較小，純度較好。試劑盒法所提取的酒醅總RNA的OD260nm/OD280nm大于2.0，表明該方法所提取的總RNA有降解發生[23]。CTAB法和月桂酸鈉法提取的酒醅總RNA樣品的OD260nm/OD280nm均較低，表明RNA樣品中存在蛋白質等物質的污染，純度較差。

從提取每個酒醅樣品總RNA所需要試劑的費用進行比較，SDS-苯酚法和CTAB法成本最低，試劑盒法成本最高，提取一次RNA的費用約49 元。5 種方法提取RNA耗時在3.5～5 h之間，試劑盒法耗時最短，其余方法在5 h左右。

2.2 總RNA完整性分析

圖1 5 種方法提取酒醅總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from fermented grains extracted by five extraction methods

如圖1所示，采用同種方法提取兩種酒醅所得RNA的電泳條帶無明顯差異，但不同方法所提RNA亮度差異較大，試劑盒法和SDS-苯酚法所提取的RNA條帶亮度明顯亮于Trizol法，CTAB法未檢測到條帶，這也與RNA質量濃度檢測結果一致。SDS-苯酚法提取酒醅總RNA中23S和16S條帶清晰整齊，5S條帶不明顯，其中23S條帶亮度與16S基本一致，說明RNA完整性較好。試劑盒法提取酒醅總RNA 23S和16S條帶模糊不整齊，電泳條帶彌散，整體提取效果一般。Trizol法提取酒醅總RNA 23S和16S條帶不夠清晰完整，5S條帶明顯，略有拖帶，表明RNA部分降解、有雜質污染，提取效果一般。月桂酸鈉法提取酒醅總RNA僅有5S條帶清晰可見且不規整，表明RNA降解嚴重，完整性差。

2.3 RT-PCR檢測分析

圖2 5 種方法提取酒醅總RNA進行RT-PCR后的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplified total RNA extracted from fermented grains with five extraction methods

采用RT-PCR實驗進一步分析上述方法所得總RNA的完整性及用于后續分子生物學實驗的可行性，結果如圖2所示。除CTAB法、月桂酸鈉法外，SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法代表的6 個泳道均出現了目的條帶，表明這3 種方法所提RNA均能有效地進行反轉錄實驗，條帶大小在290 bp左右，與預期結果一致；結合RNA純度的分析結果（表1），3 種方法所提取的總RNA基本無蛋白質污染，同時總RNA質量濃度高，對后續RT-PCR影響不大。但Trizol法提取總RNA的OD260nm/OD230nm偏低，考慮會對后續分析結果有影響，將進一步結合高通量測序結果進行分析。

2.4 高通量數據分析

表2 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對酒醅活性群落種屬鑒定結果的影響Table 2 Effect of RNA extraction methods on the identification of microbial communities in fermented grains

根據RT-PCR結果，本研究選取了SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提取的RNA反轉錄后的cDNA樣本用于高通量測序16S rRNA，結果表明，3 種方法提取的RNA對結果的影響存在差異。如圖3A所示，SDS-苯酚和試劑盒法結果相似，即發酵7 d酒醅OTU數量均高于15 d的酒醅，與Trizol法所得結果相反，說明高通量測序結果與樣品和RNA的提取方法均有關系[19]。采用上述3 種方法從酒醅中共檢測到2 個門、3 個綱、4 個目、6 個科和7 個屬，每種方法所對應每個分類水平的數量見表2。不同方法對酒醅樣品中細菌不同分類水平種屬鑒定數量（圖3B）及細菌群落Chao1指數（圖3C）沒有顯著差異（P＞0.05），說明上述指標主要是由樣品決定的。由圖3D可知，微生物群落多樣性的趨勢為SDS-苯酚法＞Trizol法＞試劑盒法，其中SDS-苯酚法所得Shannon指數顯著高于試劑盒法（P＜0.05），說明結合高通量測序分析，SDS-苯酚法所提取的RNA能更好地反映酒醅群落的群落的多樣性。

圖3 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對酒醅活性群落α多樣性分析影響Fig. 3 Effect of RNA extraction methods on α-diversity analysis of microbial communities in fermented grains

圖4 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對酒醅活性群落綱水平組成影響Fig. 4 Effects of RNA extraction methods on microbial community composition at class level in fermented grains

在原核微生物綱水平（圖4A），SDS-苯酚法和試劑盒法在2 種酒醅中提取的綱數量均一致，分別是芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia），而Trizol法除了提取到芽孢桿菌綱和梭菌綱外，在15 d酒醅中還提取到γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），但其相對豐度僅為0.01%。隨著發酵時間的延長（圖4B），SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法均表現出芽孢桿菌綱的相對豐度升高，漲幅分別為0.11%、0.05%、0.15%，相反，梭菌綱的相對豐度降低，降幅分別為0.2%、0.05%、0.16%，這可能與酒醅的特性有關，隨著發酵過程的進行，芽孢桿菌綱的乳桿菌屬作為酒醅微生物群中的優勢菌不斷增加。結果表明，不同方法提取的綱數量和相對豐度存在一定差異，但基本變化趨勢一致。

在原核微生物屬水平（圖5A），兩種酒醅共計檢測到7 個屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_10）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、短小芽孢桿菌（Brevibacillus）、水棲菌屬（Enhydrobacter）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），3 種方法提取微生物的數量和相對豐度均有一定差異。在7 d酒醅中，SDS-苯酚法和試劑盒法均提取到了5 個屬（圖5B、C），Trizol法提取到了4 個屬（圖5D）；在15 d酒醅中，SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法分別提取到了4、6、5 個屬，其中試劑盒法偏好性地提取到了類芽孢桿菌屬，Trizol法偏好性地提取到了水棲菌屬，但兩者相對豐度均僅為0.01%。隨著發酵時間的延長（圖5B～D），3 種方法所得原核微生物中相對豐度排名前3的乳桿菌屬、梭菌屬和芽孢桿菌屬的變化趨勢均一致，乳桿菌屬不斷增加，梭菌屬和芽孢桿菌屬則不斷下降，這些結果與綱水平上的結果一致。盡管3 種方法所得微生物豐度并不完全相同，但3 種方法均能反映出兩種酒醅原核微生物群之間的差異，并且規律基本一致。

圖5 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對酒醅活性群落屬水平組成影響Fig. 5 Effects of RNA extraction methods on microbial community composition at genus level in fermented grains

根據UPGMA聚類樹分析和PCA結果（圖6），Trizol法在反映樣本間差異方面的效果最好，SDS-苯酚法次之，試劑盒法則較差。雖然試劑盒法和Trizol法偏好性地提取到了1 個屬，但其相對豐度過低，不能完全反映其在發酵過程中的變化情況。所以，決定原核微生物群的因素不僅有酒醅類型，提取方法在反映其豐度變化及樣本差異方面的影響可能更大。

圖6 SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提RNA對酒醅活性群落β多樣性影響Fig. 6 Effect of RNA extraction methods on β-diversity analysis of active microbial populations in fermented grains

3 討 論

酒醅作為白酒釀造過程中微生物發酵的主要載體和白酒呈香物質的直接來源，影響其RNA提取質量的因素有多種，一般分為外因和內因：內因主要指酒醅環境中多糖、蛋白質、酚類及腐殖質等雜質含量較高，多糖類的溶解性質與RNA相似不容易被去除[24]，而蛋白質則影響RT-PCR，酚與RNA結合會影響RNA活性[25]；外因通常也影響RNA提取的質量，如實驗人員的不規范操作、實驗儀器以及試劑的污染等。因此，克服內因和外因對RNA的不良影響，是得到高質量RNA成敗的關鍵。對酒醅樣品進行預處理，則是一種簡單有效的方法，能有效地去除大量雜質，保證后續分子生物學實驗的順利進行[16]。

CTAB法在應用于酒醅提取時，濃度及純度都很低，可能是由于裂解液不能完全裂解細胞、操作步驟過于簡單、沉淀時間較短等引起的RNA質量較差。月桂酸鈉是一種生物降解性良好的陰離子表面活性劑，將其作為提取緩沖液能將植物組織中存在的多糖、色素和多酚等次生物質進行洗脫[26]，但應用于酒醅中時卻無法有效提取到RNA以及去除雜質，這可能需要結合液氮研磨提取效果才會更佳。Trizol試劑可直接從組織或細胞中提取總RNA，能迅速裂解細胞并抑制細胞釋放出來的核糖核酸酶，從而保護RNA的完整性[27]，是一種操作簡單便捷的方法，但在本研究中，Trizol法對酒醅進行總RNA提取時，所得的雜質污染較嚴重。而本研究中選用的試劑盒為目前市場上流行的E.Z.N.A.TMSoil RNA Kit（Omega）試劑盒[12,28-31]，其通過渦旋珠磨技術與苯酚-氯仿萃取相結合從樣品中分離RNA[32]，再通過離心柱和洗脫液去除DNA、蛋白質和其他雜質，既能有效去除雜質又同時具有濃縮功能，因而能獲得濃度高、純度好的RNA。本研究建立的SDS-苯酚法通過結合酒醅獨特的預處理方法，包括CaCl2去除腐殖質、PVP沉淀多糖多酚等在抽提前去除大量雜質，再通過磷酸鹽緩沖液對酒醅進行除雜和收集細胞沉淀，排除大部分雜質的干擾，有利于提升總RNA提取純度[33]；同時完善了SDS提取液配方，即在提取液中添加β-巰基乙醇，可以防止酚氧化，有助于去除蛋白質[18]；并用常見的渦旋儀代替原方法[19]中昂貴的核酸裂解儀，可供更多的實驗室選用。

已有的R N A 提取方法評價主要集中于R N A 提取效率，如濃度及純度、RT-P C R 檢測等方面的比較[6,20-24,27,32,34]，對微生物群落結構的比較研究較少。針對兩種不同時間酒醅的微生物結構和組成進行了分析，結果發現，方法本身對特定微生物專一偏好性很小。兩種酒醅中共計檢測到3 個綱、7 個屬，Trizol法偏好性地提取到1 個綱、1 個屬，占所有原核微生物類群僅為0.01%，試劑盒法偏好性地提取到1 個屬，占所有原核微生物類群也僅為0.01%。其中原因可能是3 種方法均采用了劇烈振蕩破碎細胞的方法提取RNA，這一方法能將所有微生物細胞裂解并提取RNA[19]，因此3 種方法本身的專一偏好性并不明顯。同時發現3 種RNA提取方法所得微生物組成和相對豐度并不完全相同，但3 種方法均能檢測到兩種酒醅中的優勢微生物類群，并且能反映這些優勢微生物類群在兩種酒醅中的變化規律。

4 結 論

本研究建立了一種改良的SDS-苯酚法，并比較了其與試劑盒法、Trizol法、CTAB法和月桂酸鈉法提取濃香型白酒酒醅總RNA的效果，其中：1）SDS-苯酚法和CTAB法成本較低，試劑盒法耗時最短但成本最高；2）5 種總提取方法所得RNA質量濃度為：試劑盒法＞SDS-苯酚法＞Trizol法＞月桂酸鈉法＞CTAB法；3）SDS-苯酚法和試劑盒法提取樣品總RNA的純度較高，且SDS-苯酚法電泳條帶完整性優于其他方法；4）SDS-苯酚法、試劑盒法和Trizol法所提取的RNA能有效地用于反轉錄實驗及高通量測序分析；5）RNA提取方法及樣品特性均會對酒醅微生物群落結構及多樣性解析的結果產生不同程度的影響，如SDS-苯酚法獲得的微生物多樣性明顯高于其他兩種方法，以及7 d和15 d酒醅間微生物類群存在差異，且SDS-苯酚法和Trizol法能較好地反映出這種差異。

綜上所述，本研究系統地比較了5 種常見的總RNA提取方法在濃香型酒醅RNA提取的應用效果，其中改良的SDS-苯酚法具有一定的綜合優勢，為今后以RNA為基礎的酒醅分子生物學研究提供了理論依據及方法借鑒。