沙門氏菌噬菌體LPST144尾纖維gp38的序列分析及其結合活性

楊其樂，丁一峰，張 宇，聶若男，李亞萌，王 佳，王小紅

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

沙門氏菌是導致食源性疾病的主要病原菌，在全球范圍內，每年約造成9 380萬 例腸胃炎疾病，以及15.5萬 人死亡[1]。沙門氏菌是一類革蘭氏陰性短桿菌，需氧或兼性厭氧，腸桿菌科沙門氏菌屬，由腸炎沙門氏菌種和邦戈沙門氏菌種組成[2-3]。沙門氏菌分布廣泛，菌型繁多，目前使用標準Kauffman-White方案已鑒定超過2 600 種血清型，而大多數血清型能夠在包括人類在內的多種動物宿主中寄生，其中腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌是導致人畜共患病的兩種主要血清型[4]。近年來，抗生素的大量使用導致了耐藥性沙門氏菌的出現，耐藥沙門氏菌的強毒力、高死亡率引起了廣泛關注[5]。因此，為預防沙門氏菌對人類健康以及經濟發展造成重大危害，對其進行有效的安全監控和監督、建立快速準確的檢測方法具有重要意義。

噬菌體作為一種細菌病毒，能夠特異性吸附、侵染細菌并完成自我復制[6]，最早發現于一個世紀以前，用于對分子生物學基本原理的探究[7]。在自然環境中，噬菌體幾乎無處不在，海洋、土壤、深海噴口以及飲用水、食物中都存在噬菌體。同時，噬菌體也是地球上數量最多的生物體，其數目約為1030～1031，且具有多樣性[8]。噬菌體侵染細菌，完成其生命周期的第一步是特異性識別并結合細菌表面受體，其主要識別的細菌表面受體為脂多糖和細菌表面蛋白上特定的殘基[9]，噬菌體顆粒中承擔這一重要功能的蛋白被稱為受體結合蛋白（receptor binding proteins，RBPs），存在于噬菌體尾纖維或者尾刺的末端[10-12]。由于RBPs介導的宿主識別是高度特異性的，因此，可以利用RBPs作為分子識別元件進行宿主菌的特異性檢測技術研究[13-14]。

目前報道較多的噬菌體RBPs有：T4 gp37、gp12；T2 gp38；P22 gp9和T7 gp17[15-16]。一般而言，RBPs具有如下特點：具有模塊化性質，N端連接噬菌體粒子主體，序列同源性較高，C端為受體識別區決定宿主范圍，序列相似度較低；許多已知的RBPs受體識別區富含β結構，通常會形成三聚體且結構穩定[16-17]；許多尾刺蛋白還具有水解活性，目前已知的具有水解活性的尾刺蛋白已被鑒定有215 個，這些RBPs能夠降解脂多糖、磷壁酸等生物聚合物，為噬菌體進入細胞膜注入DNA掃清道路[17]；一個噬菌體可以有多個RBPs，例如T4噬菌體具有短尾纖維（gp12）和長尾纖維（gp37）[18]，且在吸附過程中承擔著不同的功能，T4噬菌體與宿主菌靠近后，長尾纖維（gp37）識別連接細菌表面一級受體，此時的結合可逆，隨后T4噬菌體在細菌表面依靠長尾纖維移動，當周圍有2～3 個一級受體并與之相連后，信號傳遞導致底板構象改變，釋放短尾纖維（gp12），其不可逆地結合宿主二級受體，最后尾部收縮，注入噬菌體DNA[19]。由于RBPs具有以上特點，將其用作檢測探針有以下優點：易于大量獲得；RBPs具有模塊化的性質，可將受體結合區分離，改造優化，可將具有不同宿主范圍的RBPs融合表達，擴大宿主范圍[20-21]；與易發生重組和突變的完整噬菌體粒子相反，克隆原性在生產過程中保持不變，性質穩定，更適于商業化[16,22]。同時RBPs的一些性質也導致了研究的困難：首先，RBPs序列多樣性大，受體識別區序列相似性低，且一種噬菌體可能同時具有一種或者一種以上的RBPs[23]，這些特點導致生物信息學方法預測的困難[24]；其次，了解噬菌體RBPs的結構能極大促進噬菌體識別機制理論的發展，而尾纖維的柔性結構導致結晶困難，因此對結構研究和識別機制理論的揭示和發展造成了巨大的挑戰[25]。

本研究分析實驗室前期分離得到的1 株沙門氏菌噬菌體LPST144尾纖維gp38的理化性質、遺傳進化關系和二級結構，旨在完成尾纖維基因orf38異源表達純化以及其特異性結合活性的驗證，為后續開發基于噬菌體RBPs為分子探針建立沙門氏菌檢測方法奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噬菌體LPST144由實驗室前期分離保存，為1 株鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuriumATCC13311）烈性噬菌體，短尾科，T7類噬菌體；已完成其基因組測序，GenBank登錄號為MN252582；鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311（S. typhimuriumATCC13311）、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028（S. typhimuriumATCC14028）、鼠傷寒沙門氏菌ST-8（S. typhimuriumST-8）、鼠傷寒沙門氏菌UK-1（S. typhimuriumUK-1）、腸炎沙門氏菌SJTUF10978（S. enteritidisSJTUF10978）、腸炎沙門氏菌SJTUF10984（S. enteritidisSJTUF10984）、腸炎沙門氏菌10960（S. enteritidis10960）、金黃色葡萄球菌6538（Staphylococcus aureus6538）和大腸桿菌T10（Escherichia coliT10）為實驗室保藏菌種；沙門氏菌外膜蛋白Ompc為實驗室異源表達純化得到。

根據噬菌體LPST144基因組注釋結果，設計上下游引物擴增orf38基因序列，引物序列如下：orf38F：5’-CGGGATCCCGATGGCACTTAAATT-3’，orf38R：5’-CCGCTCGAGCGGATAGAAGTAGTGAAT-3’（下劃線分別代表BamH I和XhoI酶切位點），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、聚會酶鏈式反應產物回收試劑盒 寶日醫生物技術（北京）有限公司；質粒pSmart-I、E.coliBL21 美國Addgene公司；HisPur Ni-NTA Resin蛋白純化樹脂 美國Thermo Fisher公司；BCA蛋白定量試劑盒 默克生命科學；鼠抗組氨酸抗體、山羊抗鼠抗體 北京中杉金橋生物技術有限公司；脫脂奶粉 美國BD-Difco公司；9018型酶標板 美國康寧公司。

1.2 儀器與設備

5417R小型臺式冷凍離心機 貝克曼庫爾特公司；BSO-130011A2超凈臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HNY-2102C全溫振蕩培養箱 武漢瑞華儀器設備有限責任公司；M200 PRO酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體LPST144 gp38序列理化性質、二級結構和遺傳進化分析

通過在線工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）預測gp38序列的理化性質，包括等電點、不穩定系數和親水系數；使用軟件DNAMAN作多序列比對；使用NCBI CDD和Pfam數據庫預測序列保守結構域；通過在線工具PredictProtein（https://www.predictprotein.org/）預測gp38序列的二級結構；利用NCBI BLAST工具查找GenBank數據庫中與gp38具有相似性的序列，并使用MEGA7繪制進化樹（Tree method：Maximum likelihood；Max Seq Difference：0.85；Distance：Grishin）。實驗涉及到的尾纖維同源序列包括：LPST144（QEP53513）；BP12A（YP_009303689）；phiSG-JL2（YP_001949790）；SH2（YP_009289339）；SH1（YP_009289339）；phiIBBPF7A（YP_004306354）；Pf-10（YP_009145638）；Ebrios（AVJ51925）；Kvp1（YP_002308420）；Patroon（QBQ72909）；fPS-21（SOO46777）；fPS-9（SOL37536）；fPS-19（SOO46422）；fPS-89（SOO46625）；vB_KpnP_NahiliMali（QEG13382.1）；fPS-10（SOO46575.1）；vB_KpnP_Sibilus（QEG12954.1）；fPS-59（SOO46827）；vB_KpnP_Emp27（QEG11854.1）；E-2（YP_009226215）；2050H2（ASZ79018）；phiYeO3-12（NP_052117）；T7（AAM43539）；13a（YP_002003979）；YpsP-G（AFK13534）；T3（NP_523342）；phiA1122（NP_848304）。

1.3.2 尾纖維基因orf38的克隆以及重組表達載體的構建

以噬菌體LPST144的基因組為模板，設計引物orf38F（5’-CGGGATCCCGATGGCACTTAAATT-3’）、orf38R（5’-CCGCTCGAGCGGATAGA-AGTAGTGAAT-3’）（下劃線分別代表BamH I和XhoI酶切位點）擴增目的基因orf38。使用限制性內切酶BamH I和XhoI酶切擴增產物和質粒pSmart-I，參照TaKaRa公司的BamH I和XhoI說明書，配制酶切體系并選擇最佳酶切條件。按照QIAquick Gel Extraction Kit操作說明書對酶切產物進行回收，根據T4 DNA連接酶的說明書，將目的基因與質粒pSmart-I的雙酶切產物進行連接，構建重組表達載體，然后轉化BL21感受態細胞。使用質粒提取試劑盒提取重組質粒后用EcoR I和XhoI進行雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的重組質粒送至公司測序。

1.3.3 重組蛋白的表達和純化

挑取陽性單克隆接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37 ℃過夜培養。取1 mL轉接于100 mL含卡那霉素的LB培養基中，37 ℃培養至OD600nm值為0.6～0.8左右。吸取1 mL未經誘導的菌液作為陰性對照，在剩余的菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）（終濃度1 mmol/L）誘導，將加入IPTG后的菌液分別按下列條件進行培養：16 ℃培養12 h，37 ℃培養12 h，16 ℃培養4 h以及37 ℃培養4 h。收集不同表達條件的樣品，12 000 r/min離心15 min收集菌體。用10 mL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）重懸菌體，超聲破碎細胞（功率200 W），超聲時間2 s，間隔2 s，總計40 min，之后12 000 r/min離心10 min收集上清液。分別取10 μL樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗證表達情況。

取上述最佳表達條件下的上清液樣品，采用HisPur Ni-NTA樹脂親和層析純化目的蛋白，取1 mL親和樹脂裝柱，鎳柱用PBS平衡后，加入破碎后的上清樣品過柱，分別使用含有50、300 mmol/L咪唑的PBS洗去雜蛋白，并洗脫目的蛋白。純化后的目的蛋白透析處理，在0.01 mol/L PBS中，4 ℃過夜去除咪唑。將透析后的蛋白樣品利用10 kDa超濾管濃縮，4 000 r/min低溫離心30 min，棄去濾出液。將最終截留的蛋白樣品分裝置于-20 ℃保存，取5 μL進行SDS-PAGE檢測。采用BCA蛋白定量試劑盒繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。

1.3.4 重組蛋白的活性檢測

將宿主鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311培養至OD600nm值為0.8～1.2，平板計數，離心收集菌體，用1 mL無菌PBS將菌體懸浮于離心管，終質量分數為0.4%的甲醛滅活，4 ℃過夜；將滅活后的菌體用無菌PBS洗滌4 次，并以無菌PBS調整菌濃度至107CFU/mL，取100 μL宿主菌和其他6 株不同血清型的沙門氏菌（鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌ST-8、鼠傷寒沙門氏菌UK-1、腸炎沙門氏菌SJTUF10978、腸炎沙門氏菌SJTUF10984、腸炎沙門氏菌10960）包被于96 孔板，同時包被100 μL 5 μg/mL沙門氏菌外膜蛋白、100 μL 107CFU/mL滅活后的金黃色葡萄球菌6538和大腸桿菌T10以及100 μL PBS對照，4 ℃過夜；加入300 μL 3%脫脂牛奶于37 ℃封阻2 h，用PBST（含0.05%吐溫20的PBS）洗滌5 次后每孔加入100 μL 0.05 mg/mL的gp38蛋白（加100 μL PBS作為對照），37 ℃孵育1 h，再依次加入50 μL 0.2 μg/mL鼠抗組氨酸抗體（一抗）、50 μL 0.2 μg/mL山羊抗鼠抗體（二抗），每一步之間用PBST洗滌5 次。然后加入底物3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺在37 ℃顯色15 min，最后加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液終止反應，并在450 nm波長處測定吸光度。

1.4 數據處理

實驗重復3 次，每次設3 個平行。運用GraphPad Prism軟件進行繪圖和分析，實驗數據采用ANOVA進行Duncan差異分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 尾纖維蛋白gp38基本理化性質分析

利用ProtParam工具對gp38序列理化性質進行分析，gp38由646 個氨基酸組成，等電點為5.94。不穩定系數為22.37，親水系數為-0.368。一般而言，不穩定系數小于40表明該蛋白較為穩定，親水系數為負值表明該蛋白具有一定的親水性。從圖1可見，gp38的氨基酸中含量最高的是丙氨酸（A），占全部氨基酸的11.5%，甘氨酸（G）、蘇氨酸（T）、纈氨酸（V）、精氨酸（R）和天冬酰胺（N）含量較高，占比在6.5%～9.4%之間，含量最低的是半胱氨酸（C），占全部氨基酸的0.5%。非極性氨基酸占比為39.8%，極性氨基酸的占比較高為60.2%，其中帶正電荷的極性氨基酸（K+R+H）有82 個，占12.7%，帶負電的極性氨基酸（D+E）有74 個，占11.4%，其余的極性氨基酸為233 個，占36.1%。

圖1 噬菌體LPST144尾纖維gp38氨基酸組成Fig. 1 Amino acid compositions of phage LPST144 tail fiber gp38

2.2 尾絲蛋白gp38的遺傳進化分析

將噬菌體LPST144 gp38的氨基酸序列與NCBI nr數據庫做BLAST比對，根據比對結果，選擇相似度較高的序列用于后續的進化分析。如圖2所示，噬菌體LPST144與噬菌體BP12A單獨聚為一簇，相似度最高、親緣關系最近，而與其他噬菌體T7、T3等親緣關系明顯較遠，表明噬菌體LPST144和BP12A的尾纖維在序列上與nr數據庫中其他噬菌體的尾纖維具有明顯的差異。

圖2 噬菌體LPST144尾纖維gp38的遺傳進化分析Fig. 2 Genetic evolution analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

根據圖2結果，選擇親緣關系不同的8 種噬菌體尾纖維（表1）進一步比對分析。如圖3A所示，序列比對結果顯示N端保守性較好，同時在該區域預測到兩個保守結構域，分別是：1～261位尾纖維蛋白，CDD數據庫索引號為cl28018；279～331位噬菌體尾部領狀區域，Pfam數據庫索引號為pfam07484；而C端序列變異度較大。據文獻報道，噬菌體尾纖維的N端通常與噬菌體主體連接，C端負責結合宿主菌，宿主菌表面受體的多樣性導致C端序列的多樣性[26]。前期工作中鑒定了T7與LPST144同屬于Teseptimavirus屬，T7噬菌體的尾纖維gp17與噬菌體LPST144的尾纖維gp38的氨基酸序列相似度為41%，覆蓋率為54.21%。Garcia-Doval等[27]于2012年對T7噬菌體尾纖維gp17 C端377～533位進行了結構解析，結果表明T7噬菌體gp17最后84 個氨基酸（470～553位）由8 個β-折疊結構（B～I）和無規卷曲組成，形成4 個主要環狀結構（BC、DE、FG和HI環），構成T7噬菌體尾纖維尖端結構域的一個單體，是識別和結合宿主菌受體的關鍵序列。因此將這一部分區域進一步比對分析，結果如圖3B所示，總體來看，LPST144與BP12A尾纖維序列匹配非常好，在這一區間內僅有兩個堿基的差異，而與phiSGJL2、SH1、SH2和T7、YpsP-G、T3、phiA1122，分為3 組，組內各自匹配度較好，驗證了圖2進化分析的結果，另一方面，由于各組之間序列差異大，未找到整體的核心保守區。

表1 噬菌體LPST144尾纖維gp38的同源性分析Table 1 Homology analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

噬菌體T7 gp17的C末端富含β-折疊的區域是受體識別結合關鍵區，目前已知其520位的天冬氨酸（D）突變為谷氨酸（E）后可裂解E. coliB，544位的纈氨酸（V）突變為丙氨酸（A）后可裂解E. coliK12[28]，高同源性噬菌體phiA1122尾纖維523位亮氨酸（L）突變為絲氨酸（S）后，其宿主譜也發生了改變[29]（圖3B下劃線標記處）。通過分析比較LPST144 gp38 C末端的二級結構，發現同樣存在大量的β-折疊結構，推測這些富含β-折疊的區域可能與宿主表面受體的識別和結合有關。不同的是T7 gp17的金字塔結構和頂端結構之間由1 個α-螺旋結構連接，頂端結構由8 個β-折疊和無規卷曲結構組成，gp38的C末端由12 個β-折疊（a～n）結構組成，緊接的是1 個α-螺旋結構（o）。T7 gp17具有2 個半胱氨酸（C），不形成二硫鍵，gp38具有3 個半胱氨酸（C），預測結果顯示同樣未形成二硫鍵。另一方面，前期工作中已經鑒定了LPST144與BP12A屬于兩個不同的物種（未發表），理論上兩者的宿主范圍會有一定的差異，其gp38 C末端與噬菌體BP12A尾纖維C末端高度相似，僅有2 個氨基酸（533位和612位）的差異（圖3B方框標記位點），推測這2 個位點可能是受體識別和結合的關鍵位點。

圖3 噬菌體LPST144尾纖維gp38序列比對分析Fig. 3 Amino acid sequence alignment analysis of phage LPST144 tail fiber gp38

2.3 尾纖維基因orf38的克隆以及重組表達載體pSmart-I-gp38的構建

圖4 重組質粒pSmart-I-gp38雙酶切電泳圖Fig. 4 Electrophoresis profile of recombinant plasmid pSmart-I-gp38 after double enzyme digestion

以噬菌體LPST144的基因組序列為模板，設計上下游引物擴增目的基因，使用限制酶BamH I和Xho I酶切擴增產物和pSmart-I空質粒，使用T4連接酶進行連接，構建重組表達載體pSmart-I-gp38。采用Xho I和EcoR I對重組表達載體進行雙酶切鑒定，結果如圖4所示，酶切產物中包括目的條帶（約2 100 bp）和載體條帶（約5 400 bp）。同時根據重組質粒的測序結果，表明基因orf38正確插入載體pSmart-I中，重組表達載體pSmart-I-gp38構建成功。

2.4 重組蛋白的表達和純化

重組表達載體pSmart-I-gp38轉化感受態大腸桿菌BL21后，使用IPTG誘導表達，并探究在不同誘導條件下的表達效果。從圖5A可知，在80 kDa左右出現預期目的條帶，目的蛋白為82.89 kDa。另外，37 ℃誘導4 h上清蛋白表達效果最佳，目的條帶明顯，雜帶淺，因此確定選擇37 ℃誘導4 h，并選擇上清蛋白作為目的蛋白源進行純化。重組蛋白純化結果如圖5B所示，可知在75～100 kDa之間出現目標條帶，經BCA試劑盒定量測定其質量濃度為0.5 mg/mL。

圖5 gp38蛋白的表達與純化Fig. 5 SDS-PAGE profiles of expressed and purified gp38 protein

2.5 重組蛋白gp38的活性

將宿主沙門氏菌ATCC13311加入酶標板過夜，使其附著在酶標板上；脫脂牛奶封阻后加入gp38蛋白進行孵育；然后依次加入一抗、二抗和底物進行顯色，加入濃硫酸終止反應，檢測重組蛋白的結合活性。結果表明（圖6），實驗組（加gp38蛋白）的吸光度為0.94±0.02，極顯著高于陰性對照（PBS代替gp38蛋白）的吸光度0.17±0.01，表明gp38蛋白具有受體結合活性。為進一步驗證gp38蛋白的結合特異性，分別用大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白、金黃色葡萄球菌6538和PBS代替宿主沙門氏菌ATCC13311作為對照組，并測試其他6 株不同血清型的沙門氏菌。如圖7所示，對照組吸光度分別為0.58±0.03、0.56±0.01、0.59±0.03、0.53±0.005，實驗組（包括宿主在內的7 株沙門氏菌組）的吸光度較各對照組明顯更高，且gp38蛋白與大腸桿菌T10、金黃色葡萄球菌6538和外膜蛋白的結合較PBS無明顯差異，表明LPST144尾纖維gp38具有特異的受體結合活性。

圖6 重組蛋白gp38對宿主菌的結合活性Fig. 6 Binding activity of recombinant protein gp38 to host cells

圖7 重組蛋白gp38的特異性結合活性Fig. 7 Specific binding activity of recombinant protein gp38

3 討 論

沙門氏菌噬菌體LPST144是本實驗室前期分離得到的1 株短尾科噬菌體，其吸附時間短，9 min便達到最大吸附量77.57%，具有用于沙門氏菌快速檢測方法開發的潛力。通過測序分析，鑒定其與T7噬菌體同屬于Teseptimavirus屬，預測了其尾纖維gp38（發表中），本研究對其尾纖維進行了進一步的序列分析和活性鑒定。目前已知晶體結構信息的尾纖維或尾刺數量非常有限，現已有報道的RBPs晶體結構有短尾科噬菌體P22的尾刺gp9[30]、T4噬菌體的gp37[31]以及T7噬菌體的尾纖維gp17[27]，通過對LPST144 gp38進行序列分析，發現LPST144尾纖維gp38與T7噬菌體尾纖維gp17的N端序列具有較好的相似性，C端相似性卻極差。并通過遺傳進化、多序列比對和二級結構分析，發現其滿足RBPs的以下特征：具有模塊化的性質，N端保守性強而C端多樣性大；C端富含β折疊結構；序列相似性低。將其C端序列與GenBank數據庫比對，發現僅與BP12A的尾纖維具有較好的相似性，而與其他序列同源性不高。BP12A為1 株沙門氏菌噬菌體，GenBank登錄號為KM366096，經基因組比較鑒定，其與噬菌體LPST144是2 個不同的物種，理論上宿主范圍存在一定差異，而兩者的尾纖維C端僅有兩個位點（533位和612位）的差異，因此推測這兩個位點可能是受體結合關鍵氨基酸。由于PDB數據庫中缺乏能夠滿足同源建模要求的結構模板，而采用從頭計算的方法預測得到的三維結構未能通過評估，因此未能得到gp38三維結構，而LPST144的尾纖維與其他噬菌體（除噬菌體BP12A）的尾纖維幾乎沒有相似性，因此未來有必要對其空間構象進行解析，為擴寬其宿主譜提供指導依據。

目前報道的常用于沙門氏菌檢測的RBPs有短尾科噬菌體P22的尾刺gp9[17]和肌尾科噬菌體S16的尾纖維gp38[32]，本研究對短尾科噬菌體LPST144的尾纖維進行異源表達，驗證了尾纖維gp38的特異性結合能力。在異源表達實驗中，最初使用的表達質粒為pET28b，由于表達產物溶解性差形成包涵體，于是在后續的實驗中采用了攜帶His標簽和SUMO標簽的促融表達質粒pSmart-I。實驗結果表明，增加SUMO標簽能顯著提高目的蛋白的溶解性。通過考察確定最佳的誘導條件為37 ℃誘導4 h，純化后測定其蛋白質量濃度為0.5 mg/mL。在目的蛋白結合能力的實驗中，gp38蛋白加入后的吸光度較陰性對照明顯提高，表明了gp38蛋白對于宿主菌具有較強的結合能力。在驗證其特異性結合能力的實驗中，發現gp38對于宿主菌以及其他6 株受試的不同血清型沙門氏菌較大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白、金黃色葡萄球菌6538和PBS代替宿主菌對照組的吸附明顯更強，而包被大腸桿菌T10、沙門氏菌外膜蛋白和金黃色葡萄球菌6538組與PBS代替宿主菌對照組無顯著性差異，表明了gp38蛋白的結合特異性，相比于常見的酶聯免疫吸附實驗，實驗結果中對照組的吸光度偏高，推測這種現象的產生可能是由于gp38重組蛋白N端的SUMO標簽未切割所造成，產生了一定的非特異性結合。通常情況下，重組表達蛋白的活性受到表達條件（溫度、pH值等）、表達菌株和表達過程中重組蛋白是否正確折疊等諸多因素的影響，因此，后期還有待對這樣因素加以考慮并優化條件，針對這一問題進行改進。通常RBPs的宿主范圍會與完整噬菌體顆粒相當或者更為廣泛，沙門氏菌血清型眾多，目前已分離鑒定2 600多種，同時可大規模測定gp38結合的宿主范圍，以明確檢測的對象范圍。已知目前報道的用于沙門氏菌的分子探針P22 gp9和S16 gp38對部分其他血清型鼠傷寒沙門氏菌作了測試，而鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311均未被測試，一般來講，由于RBPs的序列差異大，且沙門氏菌血清型眾多（目前已發現超過2 600 個沙門氏菌血清型），能夠結合的宿主范圍差異也會很大。另一方面，本實驗是一個初步的功能驗證實驗，其目的在于證明gp38具有RBPs特異性結合活性，具有作為檢測探針的潛力，后期課題組將進一步優化gp38重組表達和活性研究并開發檢測方法。一般來說檢測靈敏度是針對檢測體系的建立，因此目前未能進行靈敏度的比較。

4 結 論

迄今為止，沙門氏菌感染仍然是世界范圍內主要的公共衛生問題，每年沙門氏菌的感染事件給人類健康以及經濟社會造成重大負擔，噬菌體作為細菌的天敵，能夠特異性吸附并侵染宿主菌，給沙門氏菌的檢測提供了新的思路。本研究對短尾科沙門氏菌噬菌體LPST144的尾纖維基因orf38進行研究，預測了其序列和結構信息，通過異源表達純化，驗證了gp38具有特異性結合宿主沙門氏菌以及實驗中其他受試沙門氏菌的能力，為開發基于噬菌體RBPs為分子探針建立沙門氏菌的檢測方法奠定了實驗基礎，同時也為理解噬菌體與宿主菌的相互作用提供了依據。