紫菜粉添加對魷魚魚糜凝膠特性及其蛋白結構的影響

徐安琪，楊 镕，朱煜康，盛珍珍，宋琳璐，賈 茹，黃 濤，楊文鴿

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211）

據測算，世界大洋中頭足類資源的總儲量近1億 t，目前全球頭足類的年捕撈量約360萬 t，其中70%左右是魷魚，也是我國重要的水產品加工原料之一。目前魷魚主要通過速凍、烘焙等，加工成冷凍魷魚塊、魷魚圈和即食魷魚絲，產品比較單一。魷魚肉厚色白、組織細膩、無骨刺、無腥味等，十分適合各種魚糜制品的加工。但秘魯魷魚肉往往含有不受人歡迎的酸澀味，而且富含內源性蛋白酶，對肌原纖維蛋白產生降解，不易形成凝膠強度高、保水性好的魚糜凝膠，大大制約了魷魚魚糜制品的開發。有關魷魚魚糜凝膠特性的改進研究有較多報道，但主要集中在淀粉、蛋白類添加劑及超高壓前處理對凝膠特性的影響。如郭穎等[1]發現添加0.3%～2.0%的轉谷氨酰胺酶可提高魷魚魚糜凝膠硬度和彈性；Kuwahara等[2]認為檸檬酸鈉能抑制魷魚肌肉蛋白的自溶活性，改進魷魚肉凝膠特性；王冬妮等[3]研究表明紅薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉和馬鈴薯淀粉可改善魷魚魚糜的凝膠特性；鄭煒[4]以秘魯魷魚為原料，研制開發高水分風味魚粒。

紫菜是我國大規模養殖的重要經濟海藻，是一種高蛋白、高纖維、低熱量、富含礦物質的藻類。但目前對紫菜深加工工藝的研究仍然有限，與紫菜加工發達的國家差距較大[5-6]。紫菜粉富含海藻多糖等活性成分，具有較好的凝膠增強和吸水能力，常被用作穩定劑、增稠劑、乳化劑和膠凝劑，將其與魚糜混合，能改善魚肉肌原纖維蛋白凝膠特性，提高制品保水能力，同時符合葷素搭配的食品營養原則。Alipour等[7]研究發現添加海藻粉和硫酸多糖延長魚糜重組產品的貨架期；吳佳莉等[8]在魚糕中添加海帶漿，產品各項性能較好；孫玥等[9]以比目魚魚糜、海帶絲為原料制得的魚丸營養豐富，風味獨特；胡巧云[10]以孔石莼超微粉為輔料，探究孔石莼的前處理方法、粒度和添加量等因素對魚丸品質的影響。但有關將海藻粉添加到魷魚魚糜中，研究紫菜粉對魷魚魚糜凝膠特性影響的研究鮮見報道。

本研究將紫菜粉與魷魚魚糜混合，探究不同紫菜粉添加量對魷魚魚糜凝膠感官、色澤、凝膠強度和持水性的影響，確定較優的紫菜粉添加量區間，并通過圓二色譜（circular dichroism，CD）、傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）分析紫菜粉對魷魚肌原纖維蛋白二級結構和魚糜蛋白構象的影響，結合掃描電鏡觀察凝膠微觀結構，探討紫菜粉改善魷魚魚糜凝膠的機理，旨在為紫菜應用于魷魚魚糜及其制品的生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秘魯魷魚魚糜由寧波飛潤海洋生物科技股份有限公司提供，-40 ℃凍藏備用；新鮮紫菜 寧波市鄞州藤葉海藻專業合作社；輔料為馬鈴薯淀粉、蛋清粉、食用油、白糖、料酒、食鹽、生姜粉 寧波歐尚超市。

1.2 儀器與設備

UMC5真空斬拌機 德國Stephan Machinery公司；CR-400色差儀 日本Konica Minolta公司；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機 德國Thermo Scientific Sorvall公司；TA.XT Plus食品物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司；FT/IR-6300 FTIR儀、J-1500-150 CD儀日本分光株式會社。

1.3 方法

1.3.1 紫菜預處理和魷魚凝膠化魚糜、魚糜凝膠的制備

取適量紫菜，105 ℃烘干后粉碎過200 目篩，得到紫菜粉。根據GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》和蒽酮-硫酸法，分別測得紫菜粉蛋白質質量分數為33.69%，多糖質量分數為18.24%。魷魚魚糜4 ℃解凍，置于真空斬拌機中低溫空斬2 min，添加2%食鹽斬拌8 min，加入紫菜粉（添加量分別為0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，以魷魚魚糜質量計）、馬鈴薯淀粉、蛋清粉、食用油、白糖、料酒、食鹽、生姜粉等輔料繼續斬拌8 min，加入冰水，將水分質量分數調節至75%。全程溫度控制在10 ℃以下。斬拌后的魷魚魚糜立即灌入直徑25 mm、長度100 mm左右的腸衣，兩頭扎緊。魷魚魚糜凝膠經二段式加熱后冷卻制成，即40 ℃加熱30 min（低溫段加熱）得到凝膠化魚糜，再于90 ℃加熱30 min（高溫段加熱），并立即置于冰水中冷卻30 min得到魚糜凝膠，不添加紫菜粉組為對照組。4 ℃保存，取樣測定各項指標。

1.3.2 感官評定

魷魚魚糜凝膠切片（5 mm厚），室溫平衡30 min，由10 位經感官評定培訓人員組成品評小組，從組織狀態、色澤、氣味、彈性、口感5 個方面進行評價[11]，評定標準見表1。采用加權法計算總分，各項指標取平均值。

表1 感官評定標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of surimi

1.3.3 白度的測定

魷魚魚糜凝膠切片（3 mm厚），使用色度儀測量L*（亮度）、a*（紅色/綠色）和b*（黃色/藍色）值。白度按式（1）計算[12]：

1.3.4 凝膠強度和持水性的測定

魷魚魚糜凝膠切成圓柱體（直徑和厚度均為25 mm），采用P/0.5S的球形探頭，使用食品物性測試儀測定。測定參數：測前速率1.0 mm/s，穿刺速率1.0 mm/s，測后速率10.0 mm/s。

離心法測定持水性[13]：準確稱取3 g魷魚魚糜凝膠樣品（W1，g），置于2 層濾紙間包裹好，放入50 mL離心管離心（5 000 r/min、4 ℃）15 min，立即取出樣品稱其質量（W2，g）。持水性按式（2）計算：

1.3.5 魚糜蛋白結構分析

參照Guan Aiyan等[14]方法。取對照組、0.4%組和0.6%組魷魚魚糜、凝膠化魚糜、魚糜凝膠干燥樣品，并分別與溴化鉀粉末1∶100混勻壓片，利用紅外光譜儀掃描（400～4 000 cm-1）。

1.3.6 凝膠微觀結構的觀察

取對照組、0.4%組和0.6%組魷魚魚糜凝膠，切成約1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定，24 h后用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）漂洗3 次，依次用30%、40%、50%、70%、80%、90%及無水乙醇梯度洗脫，隨后按無水乙醇-叔丁醇3∶1、1∶1、1∶3比例及純叔丁醇依次洗脫，最后用少量叔丁醇覆蓋樣品，冷凍干燥，貼樣、鍍金后用掃描電鏡觀察。

1.3.7 肌原纖維蛋白提取及含量測定

參考Xiong Guangquan等[15]方法。分別取對照組、0.4%組和0.6%組魷魚魚糜、凝膠化魚糜、魚糜凝膠各2 g于離心管中，加10 倍量20 mmol/L Tris-maleate緩沖液（含0.05 mol/L KCl，pH 7.0），勻漿后冷凍離心（10 000 r/min，10 min），沉淀加入10 倍量20 mmol/L Tris-maleate緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0），充分勻漿，靜置1 h后10 000 r/min冷凍離心10 min，上清液即為肌原纖維蛋白溶液。冷凍干燥，得到肌原纖維蛋白粉末，采用福林-酚法測定肌原纖維蛋白含量。

1.3.8 肌原纖維蛋白二級結構的分析

參照Guan Aiyan等[14]方法。取對照組、0.4%組和0.6%組魷魚魚糜、凝膠化魚糜、魚糜凝膠中提取的肌原纖維蛋白粉末，加水配制成0.2 mg/mL蛋白溶液。采用CD儀，選用光徑為1 mm的石英樣品池，在遠紫外區（190～250 nm）對肌原纖維蛋白溶液進行掃描，掃描速率為50 nm/min，響應時間0.25 s，以蒸餾水作為空白。

1.3.9 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離肌原纖維蛋白

參考Lv Mingchun等[16]方法。分離膠和濃縮膠體積分數分別為15%和5%，每孔樣品（對照組、0.4%組和0.6%組魷魚魚糜、凝膠化魚糜、魚糜凝膠中提取的肌原纖維蛋白溶液）上樣量為5 μL。起始電壓100 V，待溴酚藍移至濃縮膠與分離膠的交界處改為80 V，考馬斯亮藍R-250染色，凝膠成像儀拍照。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 紫菜粉添加量對魷魚魚糜凝膠感官質量評分的影響

表2 紫菜添加量對魷魚魚糜凝膠感官質量評分的影響Table 2 Effect of laver powder addition on the sensory evaluation of squid surimi gel

由表2可見，不同紫菜粉添加量對魷魚魚糜凝膠感官影響顯著（P＜0.05），隨著添加量的增加，唯有彈性逐漸減小，而組織狀態、色澤、氣味和口感都呈先增加后下降的趨勢，并分別在添加量0.6%、0.4%、0.8%和0.6%處達到最大值。當紫菜粉添加量為0.4%時，感官質量總分最高，此時魷魚魚糜凝膠切面結構緊密、無氣孔，表面有光澤，帶有魷魚和紫菜特有風味，口感比較細膩。添加量為0.8%或更高時，除氣味外，產品各項指標呈現劣化趨勢，可能是因紫菜含量過多會破壞蛋白凝膠結構或紫菜中的不溶性纖維與肌纖維蛋白競爭水分引起的品質下降。結合感官分析，紫菜粉添加量以0.4%～0.6%左右為佳。

2.2 紫菜粉添加量對魷魚魚糜凝膠色澤的影響

如表3所示，添加紫菜粉對魷魚魚糜凝膠色澤影響顯著。添加紫菜粉后，L*和a*值顯著下降，b*值顯著上升（P＜0.05）。推測是因為紫菜粉中的色素類物質使肉糜色澤發生變化[17]。紫菜粉添加量達到0.6%時，a*和b*值不再隨著添加量的升高而顯著改變，而L*值和白度仍呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。L*值反映樣品的光亮度，數值越小，魚糜凝膠表面越暗淡，a*值降低和b*值升高表明魷魚魚糜凝膠的色澤朝偏綠偏黃的方向發展（圖1），這主要受紫菜粉本身顏色影響。

表3 紫菜粉添加量對魷魚魚糜凝膠色澤的影響Table 3 Effect of laver powder addition on the color of squid surimi gel

圖1 添加不同量紫菜粉的魷魚魚糜凝膠Fig. 1 Squid surimi gels with the addition of different concentrations of laver powder

2.3 紫菜粉添加量對魷魚魚糜凝膠強度和持水性的影響

凝膠強度和持水性都是評價魚糜凝膠品質的重要指標。持水性越高，表明魚糜凝膠的網絡結構對水分等物質的束縛能力越強，蛋白質網絡結構越致密，凝膠強度就越大[18]。

圖2 紫菜粉添加量對魷魚魚糜凝膠強度和持水性的影響Fig. 2 Effect of laver powder addition on the gel strength and WHC of squid surimi gel

由圖2 可知， 對照組樣品的凝膠強度是1 112.21 g·cm，紫菜粉添加組較對照組凝膠強度顯著提高（P＜0.05），隨著添加量的增加，凝膠強度呈先上升后下降的趨勢，其中0.4%組達到最大值1 567.02 g·cm。這是因為在凝膠化過程中，加熱促使魷魚魚糜蛋白分子基團暴露，添加適當的紫菜粉，紫菜中的多糖、蛋白與暴露的魚糜蛋白基團發生相互作用，有利于形成穩定的三維網絡結構；同時紫菜粉所含的多糖具有較強的吸水性，吸水后通過氫鍵相互作用，使凝膠結構更加穩固。這與李德海等[19]研究的多糖類物質能提升肉類制品的凝膠強度結果相一致。當紫菜粉添加量大于0.6%時，凝膠強度有所下降，這可能是由于紫菜中一些不溶性組分（如不溶性膳食纖維等）阻礙了多糖與蛋白分子之間的相互作用。Debusca等[20]研究表明纖維素粉添加量低于6%時，可以增強阿拉斯加鱈魚魚糜強度，而添加量大于6%時凝膠的破斷力和破斷距離顯著下降。

紫菜粉添加后持水性顯著提高（P＜0.05），原因在于紫菜含有豐富的多糖，具有較強的吸收和保留水分的能力[21]。紫菜粉添加量在0.4%時，魚糜凝膠持水力升高幅度較大，隨后持水力升幅不顯著（P＞0.05）。Tolano-Villaverde等[22]發現在pH 7.0條件下，用2%殼聚糖處理可提高魷魚魚糜凝膠的保水能力；王希希等[17]認為蛋白質-多糖的結合達到一定飽和狀態后，繼續提高麒麟菜添加量，雞胸肉糜凝膠的持水性變化不顯著。一般地，持水性好的魚糜凝膠具有較高的彈性和凝膠強度[23]，本實驗中當紫菜粉添加量大于0.6%時，持水性和凝膠強度的變化趨勢并不一致，原因可能是過多的紫菜粉與魚糜蛋白相互作用，相應的減少了魚糜蛋白與水的作用，導致蛋白結合的水分減少[24]。綜合魷魚魚糜凝膠強度和持水性，0.4%和0.6%都是較適的紫菜粉添加量。

通過上述指標，可以看出0.4%和0.6%組魷魚魚糜凝膠強度和持水性分別達到或接近峰值，凝膠品質得到改善，因此后續取對照組、0.4%組和0.6%組魷魚魚糜、凝膠化魚糜和魚糜凝膠，分析凝膠化過程中魚糜蛋白構象、肌原纖維蛋白組成及其二級結構、魚糜凝膠微觀結構，進一步探究紫菜粉改善魷魚魚糜凝膠品質機理。

2.4 魚糜蛋白的FTIR分析

如圖3 所示，樣品在紅外區出現若干特征吸收峰，可反映蛋白質二級結構的變化趨勢。其中酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1），酰胺II帶（1 500～1 600 cm-1），酰胺III（1 220～1 330 cm-1）都有吸收峰出現。

在凝膠化過程中，魚糜蛋白中反映α-螺旋特征的吸收峰向低波數偏移，其中對照組由1 654、1 650 cm-1至1 638 cm-1，0.4%組由1 658、1 650 cm-1至1 638 cm-1，0.6%組由1 653、1 650 cm-1至1 637 cm-1，說明凝膠化過程中魚糜蛋白α-螺旋轉變為β-折疊結構，這與后續CD圖譜結果一致。酰胺II帶的特征吸收峰由60%的N—H彎曲振動和40%的C—N伸縮振動引起，凝膠化過程中，對照組在1 542 cm-1附近的酰胺II帶無明顯變化，而0.4%組和0.6%組酰胺II帶峰形逐漸變寬，表明紫菜粉促進了凝膠化過程中N—H彎曲或C—N伸縮振動的變化，并進一步影響魚糜蛋白結構的變化。對照組、0.4%組和0.6%組在1 240 cm-1附近的酰胺III帶均無明顯變化，40 ℃和90 ℃加熱后，850 cm-1附近的肌球蛋白側鏈酪氨酸殘基的峰形較為尖銳。可見在凝膠化過程中，蛋白之間相互交聯，魚糜蛋白的疏水性殘基暴露，表面疏水性增加，而疏水相互作用是蛋白質發生折疊時的主要推動力，對穩定肌原纖維蛋白網絡結構發揮重要作用[25]，這與鄧麗等[26]在研究熱加工過程中鮑魚腹足凍干樣品蛋白FTIR變化的結果相似。

圖3 凝膠化過程中魚糜、凝膠化魚糜、魚糜凝膠的FTIR圖Fig. 3 Changes in FTIR spectra of surimi with the addition of different concentrations of laver powder during gelation

2.5 魚糜凝膠顯微結構的分析

圖4 魷魚魚糜凝膠微觀結構圖（×10 000）Fig. 4 Microstructures of squid surimi gels with the addition of different concentrations of laver powder (× 10 000)

如圖4所示，對照組魚糜凝膠網絡結構比較松散，表面粗糙，孔洞大小不均一，而紫菜粉的添加使魷魚魚糜凝膠網絡孔徑變小，三維結構更加緊湊，孔洞大小和分布比較均勻。這是因為加熱促進蛋白質或海藻多糖暴露出更多的基團，二者之間的相互作用增強，從而加固凝膠網絡結構，增強對水分的束縛能力，并進一步增加凝膠強度。Zhuang Xinbo等[27]發現一定量不溶性膳食纖維有利于肌原纖維蛋白凝膠形成均勻致密的三維網絡結構。此外與0.6%組相比，0.4%組魚糜凝膠的微觀結構更加致密，可能的原因是紫菜粉添加量過高，會因為不溶性纖維的增加而阻礙蛋白質之間的交聯，對網絡結構存在一定的負面影響。張高楠等[28]研究當歸對烏鱧肌原纖維蛋白微觀結構的影響也有相似的結論。

2.6 肌原纖維蛋白的CD分析

蛋白質的圓二色性是肽鍵的相互作用引起的，其吸收范圍在波長190～250 nm，因此常用該波長范圍測量蛋白質的CD[29]。圖5為不同紫菜粉添加后凝膠形成過程中肌原纖維蛋白的CD圖，其二級結構含量如圖6所示。

在209～222 nm波長范圍內出現的雙槽曲線是α-螺旋結構的特征吸收峰[29]。由圖5可知，肌原纖維蛋白在209 nm和220 nm附近存在2 個負凹槽，表明存在α-螺旋。在凝膠化過程中，對照組肌原纖維蛋白主要呈現α-螺旋和β-轉角結構減少、β-折疊結構增加的趨勢，其中α-螺旋、β-轉角相對含量分別下降5.1%、6.6%，而β-折疊含量上升14%；紫菜粉添加組也呈現α-螺旋含量下降、β-折疊含量上升的趨勢，而β-轉角和無規卷曲變化不明顯。劉海梅等[30]研究發現，高溫蒸煮過程中鰱魚肌球蛋白α-螺旋含量減少，并轉變為β-折疊；陳燕婷等[31]發現凝膠化過程中帶魚魚糜蛋白緊密的螺旋結構向無規則狀態轉變；吳燁[32]用CD測定兔肌球蛋白的二級結構，發現在加熱過程中α-螺旋轉變成β-折疊和無規卷曲。在魷魚魚糜熱凝膠化過程中，α-螺旋含量降低代表蛋白分子展開程度增加，而β-折疊含量增加代表蛋白分子間聚集程度增加，說明加熱促進肌原纖維蛋白分子展開，α-螺旋結構部分展開并重排成β-折疊結構。加熱變性后，蛋白質分子中α-螺旋和β-轉角會轉變為β-折疊，由此推測β-折疊結構的形成也是魷魚魚糜蛋白聚集和形成凝膠網絡結構的前提條件[33]。

低溫段加熱后，與對照組相比，0.4%組和0.6%組凝膠化魚糜肌原纖維蛋白的α-螺旋結構分別上升2.4%和9.1%，β-折疊結構分別下降7.3%和7.6%，β-轉角結構中0.4%組上升3.4%，0.6%組下降0.2%，而無規卷曲相對含量無顯著變化；進一步通過90 ℃高溫段加熱，與對照組相比，0.4%組和0.6%組魚糜凝膠中肌原纖維蛋白的α-螺旋含量分別上升1.2%和5.1%，β-折疊含量分別下降2.7%和3.2%，β-轉角結構中0.4%組上升1.4%，0.6%組下降0.1%，而無規卷曲含量變化不顯著。由此可見，與對照組相比，各紫菜粉添加組的凝膠化魚糜、魚糜凝膠中肌原纖維蛋白中α-螺旋的相對含量增加，β-折疊的相對含量降低，其中0.4%組β-轉角的相對含量增加。結合魚糜凝膠的持水性和凝膠強度在0.4%和0.6%組均達到峰值，說明α-螺旋和β-轉角結構的相對含量與凝膠強度和持水性存在一定相關性。相比于伸展的β-折疊構象，α-螺旋和β-轉角結構的空間排列更為緊密，有利于更多的水分被截留，從而使凝膠網絡結構更穩固，同時也進一步解釋了0.4%組魚糜凝膠微觀結構更加致密的原因。費英等[34]認為豬肉肌原纖維蛋白的α-螺旋含量高低與其熱誘導凝膠的持水性呈正相關；王未君[33]研究發現魔芋膠有利于豬肉肌原纖維蛋白熱誘導凝膠過程中蛋白α-螺旋結構的保留，從而有利于增強凝膠保水性；張高楠等[28]通過紅外光譜發現，1%和2%的當歸粉添加量使肌原纖維蛋白的α-螺旋結構比例較對照組增大，有更高的保水性，本實驗結果與這些結論一致。由此推測，在魷魚魚糜凝膠化過程中，加熱促進肌原纖維蛋白α-螺旋結構部分展開，并重排成β-折疊，而紫菜粉的添加則有利于熱凝膠化過程中肌原纖維蛋白α-螺旋和β-轉角結構的保留，增強魚糜凝膠強度及其持水性。

2.7 肌原纖維蛋白的SDS-PAGE分析

如圖7所示，其中分子質量200 kDa左右條帶為魷魚肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC），97 kDa左右條帶為軟體動物特有的副肌球蛋白（paramyosin，PM），43 kDa左右條帶為肌動蛋白（actin，AC）[35]。

圖7 肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 7 SDS-PAGE patterns of MP in squid surimi gels with the addition of different concentrations of laver powder during gelation

40 ℃低溫段加熱后得到凝膠化魚糜，其MHC條帶明顯減弱，高溫段加熱后條帶幾乎消失，推測凝膠化過程中MHC通過分子間的共價鍵交聯成聚集，聚集體因分子過大無法進入分離膠，且有研究表明低溫凝膠化階段肌球蛋白的交聯和凝膠強度存在明顯的相關性[36-37]。與對照組相比，90 ℃高溫段加熱后，0.4%組和0.6%組MHC、PM和AC強度均有一定程度減弱，說明紫菜粉不僅促使MHC相互交聯，同時也可使AC和PM與之交聯，形成具有穩定三維網絡結構的凝膠，這與魷魚魚糜凝膠強度和持水性的變化結果基本一致。

3 結 論

在魷魚魚糜中添加適量的紫菜粉，兼有魷魚和紫菜獨特風味，同時魚糜凝膠強度和持水性顯著增強，這與紫菜粉中的多糖、蛋白具有較強的吸水能力，并與魚糜蛋白分子相互作用有關。在熱凝膠化過程中，魷魚魚糜肌原纖維蛋白的二級結構有所轉變，而紫菜粉的加入有利于魚糜凝膠保留更多的α-螺旋和β-轉角結構，增加截留水分的能力；電鏡結果顯示，紫菜粉的加入使魚糜凝膠網絡孔徑變小，結構更加致密。但過量添加紫菜粉，會削弱魚糜肌原纖維蛋白之間的交聯作用，引起凝膠強度下降。綜合來看，在魷魚魚糜中添加0.4%～0.6%紫菜粉，可有效改善其凝膠品質，為豐富魚糜制品市場提供理論依據。