用分子對接研究肟類及苯丙素衍生物抗乙肝病毒機理

王衛京，詹世平，丁仕強

（大連大學 環境與化學工程學院，遼寧大連 116622）

乙型肝炎是感染乙肝病毒（HBV）引起的臨床常見的傳染性疾病，乙肝病毒在人體內連續不斷的復制會引起肝臟病變，嚴重危害患者健康。抗乙肝病毒常見的藥物有核苷類似物和干擾素，這些藥物只能功能性抑制乙肝病毒。長期以來，研究人員一直在探索抗乙肝病毒的機理，開發新的抗乙肝病毒的藥物。

婁曉月采用體外篩選，研究了10種中藥化合物體外抗乙肝病毒的活性及其作用機制。崔新華等設計了一系列新型結構的肟及肟類衍生物，測試了其體外抗乙肝病毒活性，研究了其對表面抗原 （HBsAg）與 e 抗原 （HBeAg）的半數抑制濃度 IC50 值。Liu 等則研究了苯丙素衍生物的抗乙肝病毒活性，測試了該類衍生物對表面抗原 （HBsAg）與 e 抗原 （HBeAg）的IC50值。王勇翔通過生物學和結構生物信息學確認了乙肝病毒聚合酶的新功能區，研究了該功能區的作用機制，尋求抑制乙肝病毒聚合酶的藥物。

分子對接是大規模藥物分子虛擬篩選的重要方法，廣泛應用于藥物研究與設計領域。該方法通過計算機模擬將小分子（配體）放置于大分子靶點（受體）的結合位點，根據空間構象和相互作用在結合位點內不斷定位并尋找最佳匹配狀態。分子對接方法也被許多研究者用于抗乙肝病毒活性有效成分的篩選。姚香草用分子對接篩選了雞骨草抗乙肝病毒的活性成分，并進行了體外抗HBV 活性評價。Meng 等利用同源建模的方法構建了乙肝病毒DNA 聚合酶三維結構，以此為靶點通過分子對接研究了馬蹄金素及其衍生物的抗乙肝病毒活性。Vijayakumar Subramaniyan 等利用分子對接篩選了40種藥物植物成分，認為杠香藤酸是一個合適的抗乙肝病毒的候選藥物。

乙肝病毒HBV 基因有4 個開放閱讀框，編碼7 個蛋白，其中的乙肝病毒聚合酶，核衣殼蛋白以及x 蛋白HBx 在病毒復制過程中起重要作用。乙肝病毒聚合酶在核衣殼蛋白包裝成核衣殼顆粒中起關鍵作用，在乙肝病毒復制過程中將子代RNA 逆轉錄成DNA。核衣殼蛋白能夠自組裝成核衣殼顆粒，并調節核衣殼內逆轉錄反應。HBx 蛋白可以調節多條信號通路，實現促進乙肝病毒的逆轉錄和其DNA 復制，并調節細胞周期，是一個多功能調節蛋白。

由于核衣殼蛋白、乙肝病毒聚合酶和HBx 蛋白在乙肝病毒復制過程中均起重要作用，本文利用分子對接技術，將肟類衍生物及苯丙素衍生物同這三種蛋白進行對接，得出其結合自由能，然后再和實驗值對比，分析這些化合物在抑制乙肝病毒活性時的作用靶點，從而對其抗乙肝病毒的機理進行研究。

1 資料與計算方法

分子對接采用的肟及肟類衍生物配體來自崔新華等的研究文獻，苯丙素衍生物配體來自Liu 等的研究文獻。用ChemDraw和Chem3D 繪圖軟件畫出配體分子3D 結構，采用MM2力場對配體的分子構象進行能量優化，然后將其保存為mol2格式，作為分子對接的配體。用LeDock 分子對接軟件進行分子對接。在文獻[2]和[3]中，研究人員分別測出了化合物對HBsAg 和HBeAg 活性抑制的IC50值，本研究將其轉化為與蛋白質的結合自由能，并將其與分子對接的計算值進行對比。

在蛋白質數據庫（http：//www.rcsb.org）中下載PDB ID為5E0I 的乙肝病毒核衣殼晶體的結構，如圖1所示。目前尚未解析出乙肝病毒聚合酶的三維結構，本研究利用SWISSMODEL 網站對其進行同源模建。在美國國立生物技術信息中心（NBCI）數據庫中查詢序列號為BAQ95565.1的乙肝病毒聚合酶的一級序列，利用BLAST 程序在PDB 庫中搜索，PDB ID 為6IK9的蛋白質與其同源性最高，以該蛋白質為模板對聚合酶進行建模，模型結構如圖2所示。HBx 蛋白晶體結構目前也沒有被解析出來，在PDB 庫中沒有找到與之同源性較強的蛋白質。該蛋白質氨基酸數目較少（154個），可以采用從頭預測的方法建模。在NBCI 數據庫中找到HBx 蛋白的序列號為BAQ95563.1，然后在從頭預測網站QUARK 上對其進行建模，其三維結構如圖3所示。

圖1 核衣殼蛋白結構

圖2 聚合酶模型結構

圖3 HBx蛋白模型結構

2 結果與討論

本研究通過分子對接，計算出配體與核衣殼蛋白、聚合酶蛋白和HBx 蛋白結合自由能。將配體抑制HBsAg 和HBeAg活性的IC50值轉換，得出配體與靶蛋白結合自由能實驗值。圖4～圖9 是對接值與實驗值的對比。在6 個圖中，配體與HBx 蛋白結合自由能的對接值和HBsAg 實驗值之間數值比較接近，且變化趨勢吻合，說明二者相關性較強。

圖4 核衣殼蛋白對接值和HBsAg實驗值對比

圖5 核衣殼蛋白對接值和HBe實驗值對比

圖6 聚合酶對接值和HBsAg實驗值對比

圖7 聚合酶對接值和HBeAg實驗值對比

圖8 HBx蛋白對接值和HBsAg實驗值對比

圖9 HBx蛋白對接值與HBeAg實驗值對比

表1 是對接值和實驗值之間的均方差。對于配體與靶點蛋白的結合自由能，從表中可以看出，以HBx 為靶點得出的對接值和由HBsAg 半數抑制濃度IC50值求出的實驗值之間的均方差最小，為2.63kJ2/mol2，這說明配體與HBx 之間的對接值和實驗值最為吻合。

表1 對接值和實驗值的均方差

從以上結果可以看出，雖然核衣殼蛋白，乙肝病毒聚合酶以及HBx 蛋白均對乙肝病毒的復制過程有重要作用，但肟類和苯丙素衍生物與之對接時，與HBx 蛋白的對接值在數值上與實驗值相差最小，對接結果變化趨勢與實驗值變化最為一致，表明HBx 的對接值與實驗值的相關性最強。由此可以推測，肟類和苯丙素衍生物可能是通過抑制HBx 蛋白起到抗乙肝病毒作用，其對HBsAg 抗原活性抑制更明顯。HBx 蛋白通過多種方式促進HBV 的復制。其通過調節鈣離子信號通路，促進HBV DNA 的復制和HBV 的逆轉錄。該蛋白具有反式激活作用，對病毒或宿主基因的啟動子和增強子進行反式激活，調節HBV 的復制和轉錄過程。HBx 蛋白還可以調節細胞周期，為病毒創造一個有利于復制的內環境。肟類和苯丙素衍生物對HBx 蛋白具有抑制作用，則從多方面抑制了乙肝病毒的復制，從而起到抗乙肝病毒的作用。這也為開發抗乙肝病毒藥物提供了新思路。

3 結束語

乙肝病毒編碼的蛋白中，核衣殼蛋白、乙肝病毒聚合酶和HBx 蛋白在乙肝病毒復制過程中有重要作用。本研究采用分子對接技術，以肟類和苯丙素衍生物為配體，同三個蛋白進行對接，并將結合自由能的對接值和實驗值進行對比，分析該化合物抑制乙肝病毒活性的機理。結果顯示，以HBx 為靶點的對接值和HBsAg 的實驗值吻合性較好，其變化趨勢一致，二者之間的均方差最小，這表明肟類和苯丙素衍生物很可能是通過抑制HBx 蛋白進而抑制乙肝病毒的復制，顯示出較強的抗乙肝病毒活性，該化合物對HBsAg 抗原活性的抑制作用更強。