ARTP誘變黑曲霉高產β-葡萄糖苷酶的研究

孫 智

（1.湖北三峽職業技術學院，湖北宜昌 443000；2.三峽大學，湖北宜昌 443002）

可再生物質能源的研究是目前石油化工產業重要的研究方向之一，自然界中數量最大的可再生物質為木質纖維素，對其開發利用的關鍵在于降解為可發酵性單糖，降解中需要纖維二糖水解酶、β-葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶三者的復合酶協同作用[1]，目前存在著β-葡萄糖苷酶活力低的缺陷，本文對高產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉進行ARTP 篩選研究。常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種經過長期實踐，證明其有對操作者安全、操作簡單、環境友好、突變率高、突變快速、獲得的突變株性能穩定的特點。

1 材料與方法

1.1 材料

纖維質選取腐敗秸稈，選擇河南省長葛市楊樹崗村農業生產活動中。菌株選擇河南農業大學生命科學學院培養的菌株，通過對斜臥青霉A50原株（山東大學微生物技術實驗室提供）進行誘導之后得出青霉6號。生化試劑選擇Solarbio 公司生產的纖維二糖、AlfaAesar 公司產品生產的水楊苷、DNS顯色液、Sigma 公司生產的羧甲基纖維素鈉產品。主要培養基中，纖維二糖固體篩選培養基運用纖維二糖0.5g、水100mL、瓊脂2.0g、鏈霉素適量。菌種富集篩選培養基中運用牛肉膏0.3g、水100mL、蛋白胨1.0g、NaCl 0.5g、121℃環境下進行20min 滅菌處理。PDA 培養基中運用葡萄糖2g、水1 000mL、馬鈴薯20g、瓊脂1.5g。纖維素一剛果紅培養基中運用瓊脂1.5g、剛果紅0.05g、水100mL，pH 設定為7.0[2]。

1.2 方法

通過ARTP 技術操作快速獲得突變菌株。利用雙層平板進行高產葡萄氧化酶的初步篩選，下層平板為葡萄糖l0g/L，鄰聯茴香胺0.1g/L，辣根過氧化酶0.05g/L（200U/mg）和瓊脂粉20g/L；上層平板為20g/L 的瓊脂粉。為了保證酶的活力，待培養基溫度降低至50℃左右時候。加入辣根過氧化酶。經誘變處理后的孢子，涂布在篩選平板上，30℃培養24h，根據呈現的棕色圈的大小，挑選棕色圈較大的進行復篩將初篩得到的菌株接種到發酵培養基，200r/min、30℃培養48h，測定各自酶活，挑選出產酶提高大的菌株。

篩選β-葡萄糖苷酶產生茵。對腐敗的秸稈進行初步處理，添加10mL 無菌水，振蕩之后構成菌浮液，放置在菌種富集的三角瓶中培養，30℃環境下進行3d 培養。按照常規方式對纖維二糖固體篩選培養基進行涂布處理，3 ～7d 之后分離而得到單菌落。接種至纖維素一剛果紅培養基之中，觀察透明圈大小情況，觀察可見有透明圈的菌落，將其放置于PDA 斜面之上[3]。

鑒定菌種，這一過程中運用DNA 提取試劑盒得出基因，通過用ITS1/ITS4 引物對菌株核糖體DNA 中ITS 區域實現PCR 擴增，并將PCR 產物進行回收。按照上海生工生物工程有限公司制定的相關流程進行產物純化和測序，由此得出菌株ITSrDNA 基因序列，在GenBank 數據庫中運用NCBI.BLAST軟件輸入測序結果，以此進行同源性檢索。

產酶液體發酵，在產酶培養基中放置PDA 斜面上篩選得到的200r/rain 培菌種，在30℃環境下進行5d 培養。

提取粗酶液，將5d 培養之后的發酵液通過4層紗布過濾濾液，在6 000r/min 環境進行20min 離心處理，選取上清液作為粗酶液，在4℃環境下進行保存處理[4]。

進行β-葡萄糖苷酶活性測定，選擇0.5mL 劑量加入0.5mL 底物之中。底物的配制由檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制而得到水楊苷，質量分數為1%。50℃環境下進行30min 保溫保存，添加1.5mL DNS 進行10min 煮沸，溶液保留5mL，還原糖量測定設置550nm 環境，使用紫外分光光度計進行測量。在以上反應條件下，一個紫外分光光度計（U）表示為每分鐘1μmol 葡萄糖制造所需要的酶量。

2 結果與分析

2.1 ARTP對菌種的篩選與鑒定

研究中進行篩選培養基的培養，得出10株菌，纖維二糖作為常用碳源平板上生長較快，纖維素-剛果紅培養基培養中具有較大的透明圈。將其和實驗之前已經準備好的纖維素降解菌株共同產酶發酵，將粗酶液提取之后測定酶活力，此時酶活力最高的為B2菌，可以將其作為實驗的出發菌株。見表1。

表1 不同菌種酶活力的比較

上文分析中對B2 菌株形態學檢測，聯合運用18SrDNA測序方式，運用NCBI.BLAST 軟件對研究對象進行同源檢索，研究可得該B2菌株屬于黑曲霉（Aspergillusniger）。見表2。

表2 B2菌株18SrDNA同源性比對

2.2 最適反應溫度

在35 ～80℃溫度之下，促使底物與稀釋之后的酶液反應，檢測酶活性，可得酶活性最大值可達100%，β-葡萄糖苷酶促反應最為適宜的溫度為65℃。

2.3 最適pH

為稀釋之后的酶液與底物設置不同的反應條件與反應環境，設置pH 為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，溫度則均設置為50℃，運用實驗中經常使用的研究方法測定酶活性，得出數值最大可達100%。研究中，β-葡萄糖苷酶促反應最為適宜的pH 為4.5。

2.4 溫度穩定性

將酶液稀釋之后放置在65℃溫度下，并為其設置0min、20min、40min、60min、80min、100min、120min、140min 等不同的反應時間，運用實驗常用的研究方法進行酶活性檢測，50℃溫度下未保溫處理之后的酶液進行酶活性測量，得到100%。研究可見，β-葡萄糖苷酶通過120min 保溫之后依然具有較大的酶活性，可達61.6%。

2.5 pH穩定性

酶液稀釋之后，將其放置在pH 為3.0 ～13.0環境下進行為期1h 保溫，運用常規方法測量酶活性，實驗可得其最大數值100%。β-葡萄糖苷酶最為穩定狀態的pH 為3.0 ～l0.0，在pH 低于11.0 時，β-葡萄糖苷酶活性下降，相對活性90.6%。β-葡萄糖苷酶此次研究中最為適宜的反應溫度為65℃。

2.6 金屬離子對酶活性的影響

5mmol/L 終濃度之下得出不同的金屬離子，運用常規方式測量其酶活性，酶活性測量得100%。Mn2+運用中對酶活性促進作用最強。研究中的不同金屬包括K+、Zn2+、Ba2+、Na+、Mg2+、Ca2+，均對酶活性具有程度不同的促進作用，相對活性最高可達138.34%、137.44%。同時有部分金屬對酶活性則起到抑制作用，抑制作用強的為Cu2+，Ni2+、Al3+、Co2+，均對酶活性起著程度不等的抑制作用[5]。

3 結論

本次研究運用ARTP 對菌種的篩選與鑒定，設計實驗，提取纖維質中的β-葡萄糖苷酶產生菌，鑒定菌種，進行產酶液體發酵與β-葡萄糖苷酶活性測定，實驗完成之后進行結果分析，進行菌種的篩選和鑒定，35 ～80℃溫度下促使底物與酶液反應，檢測酶活性，可得酶活性最大值為100%，β-葡萄糖苷酶促反應最為適宜的溫度65℃。測定酶活性最大100%，β-葡萄糖苷酶酶促反應最適宜pH 為4.5。50℃進行酶活性測量，得到100%。

β-葡萄糖苷酶120min 保溫之后酶活性可達61.6%。酶液稀釋，測量酶活性，最大值100%。β-葡萄糖苷酶最為穩定狀態的pH 為3.0 ～l0.0，在pH 低于11.0時，β-葡萄糖苷酶活性下降，相對活性90.6%。β-葡萄糖苷酶最為適宜的反應溫度為65℃。5mmol/L 濃度之下得出不同金屬離子，測量酶活性，得100%。Mn2+對酶活性促進作用最強。金屬包括K+、Zn2+、Ba2+、Na+、Mg2+、Ca2+，均可促進酶活性，抑制作用強的為Cu2+，Ni2+、Al3+、Co2+，均對酶活性起著程度不等的抑制作用。這些特性有助于促進木質纖維素酶化與理化的復合預處理，產酶菌株黑曲霉可進行大規模發酵生產，以滿足生產需要。本研究分析的高產β-葡萄糖苷酶黑曲霉為纖維素高效降解酶制劑菌材料的選取提供了新的方向與思路。