結直腸癌病人miR-21、血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶-9表達與臨床特征及預后的相關性

張健 李玉梅 何志軍 陳亮 王佩 梁俊 明月

結直腸癌的發生受遺傳、環境等多因素影響，是從正常黏膜-腺瘤-癌的演變過程[1-2]。miR-21可調節下游血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9的表達[3]，在結直腸癌組織中表達升高。VEGF在腫瘤組織中呈高表達狀況[4]，具有很強的促進血管內皮細胞分裂增生的能力。MMP-9的高表達可促使腫瘤組織微血管、微淋巴管的生成，其與VEGF可發揮協同作用，從而促使惡性腫瘤擴散和轉移的發生[5]。本研究探討結直腸癌病人miR-21、VEGF、MMP-9的表達及其與預后的相關性。

對象與方法

一、對象

2013年12月～2016年6月我院收治的結直腸癌病人144例。男84例，女60例；年齡≥60歲 104例，<60歲40例；腫瘤直徑>4 cm 78例，≤4 cm 66例；分化程度：高分化32例，低分化78例，中分化34例；淋巴結轉移44例；臨床分期：Ⅰ期74例，Ⅱa期70例。納入標準：病理檢查確診為結直腸癌；年齡30～75歲，臨床分期為Ⅰ～Ⅱa期，具有手術指征，術前無放化療治療史；病人臨床資料完整。病人愿意參加本研究。本研究得到醫院倫理委員會批準。排除標準：結直腸癌晚期出現心、肝、腎等多器官損傷；過敏體質、皮膚易出血；伴急性腸梗阻、穿孔等并發癥；臨床資料缺乏；妊娠或哺乳期婦女及女性育齡病人。

二、方法

1.手術方法：所有病人均給予腔鏡下根治手術。氣管插管，建立氣腹，維持氣腹壓力在13～15 mmHg。進鏡觀察腫瘤的位置與性質。根據腫瘤的位置與性質采用相應的手術方式，結扎腫瘤所在部位的血管，清除脂肪淋巴組織。術后均選擇對應的吻合方式，對腹腔進行充分沖洗，留置引流管，逐層關腹。

2 miR-21、VEGF、MMP-9的檢測：腫瘤組織為病人腫瘤組織織新鮮標本；非腫瘤組織為正常腸黏膜(距癌組織≥5 cm)新鮮標本。兔抗人VEGF多抗購自英國Abcam公司(稀釋濃度為1∶500)；鼠抗人MMP-9單抗(稀釋濃度1∶200)均購自福州邁新生物技術開發有限公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照，已知的結直腸癌組織作陽性對照，實驗步驟按照說明書操作。VEGF、MMP-9細胞核棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，無染色0分，陽性細胞百分比≤5%為0，6%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，>75%為4，乘積≥4分為表達陽性。同時提取組織的總RNA。經逆轉錄得到的cDNA按SYBR Green Supermix說明書進行實時定量熒光PCR分析，檢測miR-21相對表達水平(≥3表示為表達陽性)，以U6作為內非腫瘤組織。

3. 觀察指標：分析所有病人的臨床一般資料與病理資料；隨訪至今，記錄病人的預后。資料收集完畢后，對記錄項目統一進行編碼與保管。

三、 統計學處理

結果

1.miR-21、VEGF、MMP-9表達比較見表1。結果表明，腫瘤組織的miR-21、VEGF、MMP-9表達陽性率高于非腫瘤組織，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 miR-21、VEGF、MMP-9表達情況(例，%)

2. 結直腸癌VEGF、MMP-9和miR-21表達與臨床病理特征的關系見表2、表3、表4。在144例病人中，腫瘤組織miR-21、VEGF、MMP-9的表達陽性與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、臨床分期、腫瘤直徑密切相關(P<0.05)。

表2 結直腸癌VEGF表達與臨床病理特征的關系(例，%)

表3 結直腸癌MMP-9表達與臨床病理特征的關系(例，%)

表4 結直腸癌miR-21表達與臨床病理特征的關系(例，%)

3. 預后情況:所有病人隨訪到2019年10月，死亡34例，死亡率為23.6%。

4.影響因素分析見表5。結果表明，在144例病人中，以是否死亡作為因變量，以miR-21、VEGF、MMP-9作為自變量納入COX回歸模型，結果顯示,miR-21、VEGF、MMP-9等是影響結直腸癌病人預后的因素(P<0.05)。

表5 影響結直腸癌病人預后的因素

討論

隨著人口老齡化，飲食習慣及生活方式的改變，結直腸癌發病率逐年增加。以手術為基礎的綜合治療為結直腸癌的主要治療方法。腹腔鏡下結直腸癌根治手術創傷小、恢復快，是結直腸癌手術的標準術式。但是也有部分病人預后不佳，說明病人自身相關因子的表達情況可影響病人預后[6]。

VEGF的高表達與血管生成、動脈粥樣硬化等有顯著相關性，在結直腸癌進展過程發揮重要作用。MMP-9高表達情況下可使得膠原和明膠等發生降解作用，促使腫瘤微淋巴管的新生，也可促使腫瘤細胞突破基底膜導致浸潤性轉移發生[4]。MMP-9在結直腸癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、食管癌中均呈現高表達狀態，腫瘤細胞的高侵襲轉移能力與MMP-9的過表達顯著關聯。腫瘤特異性的miRNAs表達譜對腫瘤的鑒別診斷與預后預測具有重大的意義[7]。miR-21是由72nt的莖環結構前體加工成熟的miRNA，其編碼基因位于17q23.2染色體區域，具有原癌基因活性，可調節VEGF與MMP-9的表達情況，從而參與細胞增殖和侵襲并抑制細胞凋亡，抑制靶基因的的表達，從而促進腫瘤的生長、侵襲與轉移[8]。本研究顯示，腫瘤組織miR-21、VEGF、MMP-9表達陽性率高于非腫瘤組織；腫瘤組織的miR-21、VEGF、MMP-9的陽性表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、臨床分期、腫瘤直徑密切相關，表明結直腸癌病人伴隨有miR-21、VEGF、MMP-9的高表達。

本研究COX回歸模型結果顯示，miR-21、VEGF、MMP-9等是影響結直腸癌病人預后的因素，表明miR-21、VEGF、MMP-9的表達可能影響病人的預后。本研究隨訪時間短，沒有對miR-21、VEGF、MMP-9之間的相互關系進行深入分析，實驗數據收集存在差異。