微小RNA-193a-3p和生長基因1抑制劑在食管癌中的表達和臨床意義

胡少宏 唐鎮(zhèn) 劉香庭

食管癌在癌癥相關死亡的原因中排名第六[1]。目前，食管癌的治療手段在不斷提升，但病人的預后仍然未得到明顯改善，研究新的治療靶點具有重要臨床意義[2-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼RAN，可作為抗腫瘤治療的靶點[4]。miR-193a-3p在結直腸癌、胰腺導管腺癌和非小細胞肺癌等惡性腫瘤中被報道為抑癌基因，其過表達可以抑制腫瘤增殖、侵襲和轉移等多種腫瘤惡性進展行為[5-7]，但是在食管癌中miR-193a-3p的過表達卻會增加食管鱗狀細胞癌細胞的輻射抗性和化學抗性[8]。生長基因1抑制劑(inhibitor of growth gene 1,ING1)是腫瘤抑制基因[9]，其與包括非小細胞肺癌和膠質母細胞瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[10-11]。本研究探討miR-193a-3p和ING1在食管癌中的表達水平和臨床意義。

對象與方法

一、對象

2013年1月～2014年6月于我院診治的食管癌病人90例。納入標準：(1) 均為首次入院行食管癌切除治療；(2)經(jīng)病理檢查確診；(3) 具有完整的臨床病理資料和隨訪資料；(4)之前未接受過抗腫瘤治療。排除標準：腫瘤發(fā)生遠處轉移；患有其他類型腫瘤；合并影響生命健康的慢性疾病病人。收集手術切除的食管癌組織樣本及其配對的癌旁組織樣本(癌旁組織距離癌組織5 cm以上)。90例病人中，男性68例，女性22例；年齡≤60歲者36例，>60歲者54例；組織類型：鱗癌82例，腺癌8例；腫瘤位置：上段23例，中段41例，下段26例；淋巴結轉移：有35例，無55例；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期37例，Ⅲ期33例。所有病人或者家屬均簽署知情同意書，本實驗的所有操作均由我院倫理委員會審核通過。

二、方法

1.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：采用qRT-PCR檢測食管癌和癌旁組織中miR-193a-3p的表達。手術切除的組織標本立即置于液氮中凍存，研磨成粉末后，加入TRIzol試劑裂解組織，加入氯仿混勻后低溫高速離心，吸取上層上清液與異丙醇等體積混勻后離心，加入DEPC水獲得RNA，經(jīng)Nanodrop2000測得其濃度。將RNA逆轉為cDNA，以其為模板，加入基因引物和PCR試劑進行擴增反應，按照兩步法進行：95 ℃ 30秒和60 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒40個循環(huán)。7 500上機檢測各樣品的循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)。以U6基因為內參，用2-△△Ct法計算miR-193a-3p相對表達量。miR-193a-3p引物F:5′-GCATAACTGGCCTACAAAGT-3′,R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6引物F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2.免疫組化(IHC)檢測：采用IHC檢測食管癌和癌旁組織中ING1蛋白的表達。手術切除的組織標本經(jīng)中性甲醛固定，酒精脫水和石蠟浸泡包埋成蠟塊，經(jīng)切片機制成厚度為4μm的石蠟切片。切片經(jīng)烤箱和二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，在枸櫞酸鈉抗原修復液中經(jīng)高溫高壓進行抗原修復，并經(jīng)3%過氧化氫酶和非免疫羊血清共孵育封閉非特異性抗原，加入ING1一抗稀釋液(1∶100)4 ℃孵育15小時，陰性對照為PBS孵育。PBS洗三次后二抗37 ℃孵育30分鐘。顯色液常溫孵育2分鐘，蘇木素染核2分鐘，二甲苯透明后封片。在高倍顯微鏡下觀察染色情況，以染色面積和染色強度進行綜合評分，染色面積0～5%計為0分，6%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，大于75%計為4分。染色強度無計為0分，弱計為1分，中計為2分，強計為3分；二者之和≥4分為陽性表達，0～3分為陰性表達。

3.隨訪：所有病人手術后1個月開始隨訪。采用電話隨訪以及門診復查，隨訪截止到2019年6月。

三、 統(tǒng)計學分析

結果

1.miR-193a-3p在食管癌組織中的表達水平比較：miR-193a-3p在食管癌組織中的相對表達水平為(1.52±0.71)，癌旁組織為(1.04±0.51)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05))。

2.ING1在食管癌組織中的表達：ING1在食管癌組織中的陽性表達率為31.11%，癌旁組織的陽性表達率為55.56%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 IHC檢測ING1在食管癌組織中的表達(例，%)

圖1 IHC檢測ING1在食管癌組織中的表達(SP染色法，×200)

3.miR-193a-3p與ING1靶向關系的預測：應用Target Scan7.1生物學信息軟件預測miR-193a-3p與ING1靶向關系。結果顯示，ING1的3′UTR區(qū)存在miR-193a-3p的結合位點。見圖2。

表3 miR-193a-3p和ING1在食管癌組織中的表達水平與病人臨床病理參數(shù)之間的關系

圖2 Target Scan7.1預測miR-193a-3p與ING1的3＇UTR區(qū)的結合位點

4.miR-193a-3p和ING1在食管癌組織中表達的相關性見表2、圖3。按照miR-193a-3p在食管癌組織中的相對表達量1.52為界，將90例食管癌病人分為miR-193a-3p高表達病人(49例)和miR-193a-3p低表達病人(41例)。結果顯示，miR-193a-3p與ING1在食管癌組織中的表達呈負相關(P<0.05)。

表2 食管癌組織中miR-193a-3p和ING1表達的相關性

圖3 相關性分析(n=90)

5.食管癌組織中miR-193a-3p、ING1表達水平與病人臨床病理參數(shù)之間的關系見表3。miR-193a-3p、ING1在食管癌組織中的表達水平與病人的性別、年齡、組織類型、腫瘤位置無關(P>0.05)，與TNM分期和淋巴結轉移相關(P<0.05)。

6.食管癌組織中miR-193a-3p、ING1表達水平對病人預后的影響見圖4。對90例病人隨訪資料進行整理，繪制Kaplan-Meier生存曲線，分析miR-193a-3p和ING1對病人預后的影響。結果顯示90例病人中死亡病例52例，存活病例38例。

A:miR-193a-3p高表達食管癌病人預后較差B:ING1低表達食管癌病人預后較差

miR-193a-3p高表達組死亡31例，存活18例，5年生存率為36.73%(18/49)；miR-193a-3p低表達組病人死亡21例，存活20例，5年生存率為48.78%(20/41)。miR-193a-3p高表達的病人預后比miR-193a-3p低表達的病人預后較差(P<0.05)。ING1陽性表達組死亡13例，存活15例，5年生存率為53.57%(15/28)；ING1陰性表達組死亡39例，存活23例，5年生存率為37.10%(23/62)。ING1陰性表達的病人預后比ING1陽性表達的病人預后差(P<0.05)。

討論

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，每年死于食管癌的病例數(shù)超過27萬，且具有增長趨勢[12]。食管癌的治療包括外科手術、化學療法和放射療法等傳統(tǒng)治療方法。聯(lián)合治療在改善預后方面取得了一定的進展，但由于食管癌病人缺乏特定的癥狀和有效的早期診斷方法，確診時往往已經(jīng)處于晚期，一旦發(fā)生遠處轉移或者復發(fā)，病人將失去手術切除機會，病人5年生存率僅為25%～30%[13]。食管癌的主要危險因素為吸煙、飲酒、食用腌制蔬菜和霉菌毒素污染的食物等[14]，但是其發(fā)病的具體機制尚未完全闡明。

miRNA屬于內源性非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，其可與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結合，從而導致mRNA降解或功能性抑制蛋白質翻譯，進而調節(jié)基因表達[15]。miRNA的調控作用涉及各種系統(tǒng)性疾病，多種miRNA在惡性腫瘤中表達失調，進而參與腫瘤的增殖、分化、凋亡、侵襲、轉移和耐藥等多種惡性生物學行為[16]。miR-193a-3p位于人類17q11.2號染色體上，LaRos-Quintana等[17]研究表明，miR-193a-3p是一種腫瘤抑制劑和壁細胞的轉化因子，在多種疾病中起著重要作用。在結直腸癌中miR-193a-3p的過表達抑制了腫瘤細胞的增殖、遷移和血管生成[5]，miR-193a-3p在胰腺導管腺癌組織中的表達低于非癌性組織中的表達，在腫瘤細胞中過表達miR-193a-3p后，細胞增殖能力被抑制，細胞凋亡和細胞周期被誘導[6]。以上研究均表明，miR-193a-3p在結直腸癌和胰腺導管腺癌中的高表達有抗腫瘤作用。然而，在關于鼻咽癌和胃癌的報道中，miR-193a-3p表達的增加與腫瘤細胞放射抗性和化學耐藥相關[18-19]，同樣miR-193a-3p的過表達可以增加食管鱗狀細胞癌細胞的輻射抗性和化學抗性，提示miR-193a-3p具有促進腫瘤發(fā)展的作用。本研究結果顯示，miR-193a-3p在食管癌組織中表達上調，且其高表達與病人的淋巴結轉移和TNM晚期相關，表明miR-193a-3p可能參與了食管癌的惡性進展。本研究還對食管癌病人的生存率進行了分析，結果顯示miR-193a-3p高表達的食管癌病人5年生存率較差，提示miR-193a-3p可能是食管癌預后不良的標志分子。

miR-193a-3p可以通過調控纖溶酶原激活物尿激酶(PLAU)、細胞周期蛋白D1(CCND1)和p21激活的激酶4(PAK4)等靶基因發(fā)揮作用[5-7]。靶基因是miRNA發(fā)揮調控作用的重要機制，每個miRNA可以存在成千上百個靶基因，本研究通過軟件預測發(fā)現(xiàn)ING1基因的3＇UTR區(qū)存在與miR-193a-3p兩個結合位點，其可能是miR-193a-3p的靶基因。ING1屬于INGs家族，其家族由ING1-5組成，發(fā)揮Ⅱ型腫瘤抑制作用，ING1通過多種途徑調節(jié)細胞增殖、凋亡、分化、血管生成、轉移和侵襲等生物學過程，此外ING1還可增加癌細胞對化學療法和放射療法的敏感性，ING1是潛在的抗腫瘤治療靶點[20]。ING1的過表達可顯著抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡[10]。在膠質母細胞瘤中抗原生動物藥物Nitazoxanide(NTZ，硝蟲唑)通過上調ING1的表達抑制自噬的發(fā)生，誘導腫瘤細胞周期停滯導致細胞生長抑制[11]。本研究采用免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)ING1蛋白在食管癌組織中表達下調，且其陰性表達與病人的淋巴結轉移和TNM晚期相關，同時ING1陰性表達的食管癌病人5年生存率較差，表明ING1低表達參與了食管癌的惡性進展，其可能是食管癌預后不良的標志分子。采用Pearson線性相關分析對miR-193a-3p和ING1在食管癌中的表達水平進行了分析，結果顯示兩者表達呈負相關性，表明miR-193a-3p可能通過靶向ING1基因共同參與食管癌的進展。

綜上所述，miR-193a-3p在食管癌中高表達，ING1在食管癌中低表達，兩者的表達呈負相關性，并且均與食管癌病人不良病理參數(shù)和預后相關，miR-193a-3p可能通過調控ING1的表達促進食管癌的發(fā)生發(fā)展，miR-193a-3p和ING1有望成為食管癌治療的候選靶點。