疫情期間醫院配備新型冠狀病毒核酸檢測設備方案的探討

袁 勛，顧澤華，邵 蕾

1.上海市中醫醫院醫學裝備管理處，上海 200071；2.同濟大學附屬同濟醫院編輯部，上海 200065

2020年4月18日，國務院印發了《關于進一步做好疫情期間新冠病毒檢測有關工作的通知》，要求三級醫院具備獨立開新冠病毒檢測能力。新型冠狀病毒與SARS 冠狀病毒是同一類，但不是同一種。2020年1月12日被世界衛生組織命名為2019-nCoV，2020年2月11日被國際病毒分類委員會命名為SARS-CoV-2。

患者在感染了新型冠狀病毒后最為常見的臨床表現為咳嗽、發熱、氣促和呼吸困難等呼吸道癥狀。較為嚴重的患者可能導致肺炎、嚴重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡的情況。

確診病例需有病原學證據陽性結果(實時熒光RT-PCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性；或病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源)［1］。

具備新冠疫情檢測能力就要求醫院具備二級以上實驗室，具備核酸檢測的能力。

1 核酸檢測原理

1.1 原理

除病毒之外的所有生物均由細胞所組成，核酸是在細胞核里面的一類生物聚合物，是所有已知生命均有的生物化學成分，參與遺傳物質保存、繁殖等生化合成和細胞代謝，決定著細胞或機體的性狀表現。

病毒作為最簡單的一種生物，是由核酸和蛋白質構成。核酸由核苷酸組成，而核苷酸單體由5-碳糖、磷酸基和含氮堿基組成。如果聚合物中核苷酸的5-碳糖是核糖，則形成的聚合物是核糖核酸(簡稱RNA)；如果5-碳糖是脫氧核糖，則形成的聚合物是核糖核酸(簡稱DNA)。

每一個生物的核酸是不一樣的，通過核酸檢測就是要確定人身上是否帶有病毒，也就是為了檢出病毒的攜帶者。病毒攜帶者如果有癥狀的話就是患者，如果沒有癥狀就是無癥狀感染者。

1.2 核酸檢測操作流程

采樣→樣本包裝→樣本送檢→樣本接收→樣本保存和管理→核酸檢測(樣本前處理→核酸提取和加樣)→結果判讀與報告→檢測后樣本的處理和保存

1.2.1 采樣要求

鼻咽拭子：拭子貼鼻孔進入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入。待拭子頂端到達鼻咽腔后采集拭子，見圖1。將拭子頭浸入含2～3 mL 病毒保存液(也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液)的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

圖1 鼻咽拭子采集示意圖Fig.1 Schematic diagram of nasopharyngeal swab collection

咽拭子：拭子放入無菌生理鹽水中濕潤(禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏)，將拭子越過舌根，兩側咽扁桃體、咽后壁上下擦拭至少3 次，見圖2。將拭子頭浸入含2～3 mL 病毒保存液(也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液)的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管中［2］。

圖2 咽拭子采集示意圖Fig.2 Schematic diagram of pharyngeal swab collection

深咳痰液：要求被采集人員深咳后，將咳出的痰液收集于含3 mL 采樣液的50 mL 螺口塑料管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前，加入2～3 mL 采樣液，或加入痰液等體積的痰消化液。

1.2.2 病毒核酸檢測基本要求

實驗室按試劑說明書編寫試劑準備、病毒滅活、核酸提取、擴增檢測、結果分析及報告等的標準操作程序，并在各個區域的操作過程中嚴格遵照執行。嚴禁混樣檢測。

樣本前處理要求

(1)在標本制備區的生物安全柜內取出樣本，用75%乙醇消毒樣本容器。

(2)咽拭子和鼻咽拭子建議病毒滅活后再進行核酸提取。

(3)病毒滅活要求：56 ℃，滅活時間30～45 min。注意：如使用干預滅活，需保證樣本管與金屬浴管壁密切接觸。

(4)對痰液應充分振蕩混勻后進行病毒滅活。

(5)痰液如果有濃痰無法吸樣時，可嘗試進行液化處理，在滅活標本中加入4 倍體積4% NaOH，室溫放置10 min，12000 r/min 離心5 min，去上清后加入生理鹽水懸浮，12000 r/min 離心5 min，去上清后再用生理鹽水懸浮，12000 r/min 離心5 min，去上清后留約200 μL用于核酸提取。

1.2.3 核酸提取和加樣要求

(1)核酸提取和加樣應在生物安全柜內完成。

(2)為保證人員安全和核酸提取純度和效率，建議采用基于磁珠吸附的自動化核酸提取方法。

注意：需選用試劑盒內配套或推薦的核酸抽提試劑。

2 場地要求

2.1 國家實驗室設置、設施與環境要求

(1)具備臨床基因擴增檢驗實驗室資質、經過備案的生物安全二級及以上實驗室等條件。

(2)至少參加1 次室間質評并合格。室間質評結果不合格的，不允許開展新冠病毒檢測。

(3)實驗室應符合生物安全有關規定，實驗室分區應能有效地防止擴增產物和標本間的交叉“污染”。

2.2 醫院場地改造要求

按照衛生部辦公廳關于印發《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法的通知》(衛辦醫政發〔2010〕194 號)的要求與實際操作步驟需要建立采樣區、試劑準備區、樣本制備區、擴增區。檢驗科將原有的45 m2二級實驗室劃分為3 個區域(試劑準備區、樣本制備區、擴增區)。試劑準備區13 m2，+10 Pa 的主要功能：試劑的制備和貯存、試劑的分裝、主反應混合液的制備。樣本制備區22 m2，-15 Pa的主要功能：核酸(RNA、DNA)提取、貯存，擴增反應管的制作。擴增區10 m2，-20 Pa 的主要功能：核酸擴增，擴增片段的測定。

采樣區設置在發熱門診附近的臨時采樣篷里。為避免交叉污染，采用全新風空調系統；陰陽角均用圓弧角密封處理；門必須設置自動互鎖(機械或電子)，設有專用工作服/衣柜，實驗室的門應有可視窗；在實驗室內應配備生物安全柜；設置緩沖間，緩沖間為正壓；室內壓差值需-5 Pa～-20 Pa，見圖3。

圖3 場地設計安排Fig.3 Space design and layout

3 設備

3.1 按照二級實驗室新冠檢測要求需要配置設備

與醫院實際情況對應，見表1-3。

表1 準備區所需的設備清單Tab.1 A list of equipments required for the staging area

3.2 需采購設備

目前需采購全自動核酸提取儀1 臺、全自動核酸檢測前處理系統1 臺、冰箱2 臺、氣溶膠吸附器5 臺、56 ℃水浴箱1 臺。其中自動核酸檢測前處理系統最為關鍵，它是核酸檢測過程中的鏈接環節。

4 核酸檢測儀性能對照

以下為各型號的核酸檢測儀的參數新冠病毒核酸檢測對比，見表4。

4.1 RNA提取方法比較

4.1.1 磁珠法核酸提取

原理：磁珠法中的細胞裂解液是一種蛋白變性劑，可使動植物的細胞裂解，并使與DNA 或RNA 結合的蛋白質變性，DNA 或RNA 游離釋放，磁珠可以特異地吸附DNA 或RNA，通過洗滌，去除DNA 或RNA 以外的蛋白質、多糖等雜質，再用洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA或RNA，得到純度和濃度均很高的DNA或RNA［3］。

主要步驟，見圖4。優點：(1)能夠實現自動化、大批量操作，符合生物學高通量的操作要求，使得傳染性疾病爆發時能夠進行快速及時的應對［4］。(2)操作簡單、用時短，整個提取流程只有4步：裂解→結合→洗滌→洗脫，大多可以在36～40 min 內完成；(3)安全無毒，不使用傳統方法中的苯、氯仿等有毒試劑，對實驗操作人員的傷害減少到最少；(4)磁珠與核酸的特異性結合使得提取的核酸純度高、濃度大［5］。

表2 標本制備區所需的設備清單Tab.2 A list of equipment required for the specimen preparation area

表3 擴增分析區所需的設備清單Tab.3 A list of equipments required for the amplification and analysis area

4.1.2 硅膠膜吸附法核酸提取

原理：在高鹽緩沖液條件下，硅膠膜會吸附核酸，而對其他生化成分如蛋白質、多糖、脂類既不相親也不吸附，在經過數次緩沖洗滌離心后，吸附在膜上的DNA 或RNA 已經很純，這時再用適當體積的低鹽緩沖液進行洗脫。

主要步驟，見圖5。優點：吸附DNA的硅膠膜可以長期保存，為了避免DNA 的降解，在整個DNA 提取和保存的過程中操作快速、簡便、廉價。

表4 各型號的核酸檢測儀的新冠病毒核酸檢測試劑信息Tab.4 Novel coronavirus nucleic acid test reagents of different types of nucleic acid detectors（first approved）

4.2 陽性判斷Ct值

Ct 值是指在實時監測擴增過程中的熒光信號達到指數擴增時的循環周期數。一般情況下Ct 值越大越好。

圖4 磁珠法核酸提取步驟Fig.4 Steps for nucleic acid extraction by magnetic bead method

圖5 硅膠膜吸附法核酸提取步驟Fig.5 Steps for nucleic acid extraction by silica gel membrane adsorption method

4.3 靈敏度

靈敏度=熒光采集增量/檢測樣本增量。單位樣本采集越高，靈敏度越高，核酸檢測準確率也越高。結合以上3點，之江生物的核酸檢測儀較為優秀。

5 采購方案

5.1 設計采購方案

明確建設核酸檢測能力的方法后，針對我院實際情況做出2套方案。

方案一(備注：設計方案時國家衛健委未發布公告規定必須雙靶點及以上)：

采購全自動核酸檢測分析系統，直接出檢測報告?，F有檢驗科2級實驗室條件下不用改動房屋設施，見表5。

表5 方案一情況表Tab.5 Scenario 1

方案二：

原有二級實驗室加裝一臺全自動核酸提取儀+基因擴增儀PCR(醫院現有設備)，見表6。

表6 方案二情況表Tab.6 Scenario 2

5.2 確認采購方案

我科室與臨床科室開會討論，從效率、成本、合規性，安全性這4 個主要的方面對以上2 套方案進行比較。

5.2.1 合規性

方案一：上海仁度單靶點檢測，與第5期新冠疫情要求雙靶點以上檢測有出入，不符合要求。之江生物Autrax 全部條件都符合。方案二：全部條件都符合，臨床科室已確認。

上海仁度不符合國家衛健委的要求因此不再作考慮。

5.2.2 安全性

方案一：之江Autrax 全程不開蓋操作，風險較低。方案二：之江AutraMic 全程不開蓋操作，風險較低；碩世到PCR 端需要重新加樣，風險較高；達安、PE、圣湘不開蓋操作，風險較低。碩世需人工開蓋操作，風險較高，因此不再作考慮。

5.2.3 效率

方案一：之江Autrax 為一體機，無需PCR，樣本直接檢測，全程無泄露，需等待88 個樣本再同時檢測。方案二：為全自動核酸提取儀+PCR，一天檢測兩次，需要等待60-80樣本再同時檢測，檢測后需要消毒，影響新冠檢查工作及時性，要準備大量患者等候區域。優點在于試劑可以開放，疫情結束后，仍可檢測乙肝，丙肝等。

5.2.4 場地

方案一：之江Autrax 符合現有場地情況。方案二：之江AutraMic、PE 符合現有場地情況。達安、圣湘設備體積較大，不符合現有場地情況。

圖6 核酸檢測結果報告Fig.6 Nucleic acid test report

綜上所述，結合效率、合規性、場地與臨床科室意見等總體考慮，由于PE 沒有現貨，需等待2 個月，最終將方案二之江全自動核酸提取儀之江AutraMic +PCR 確定為最優方案。并需額外采購5臺氣溶膠吸附器，放置在采樣點，PCR實驗室。

在此次疫情期間，如何盡快實現醫院的新冠病毒核酸檢測能力是各家醫院的頭等大事。只有了解病毒原理，通過場地合理布局，產品性能比較，流程安全評估，設備及時采購，才能確保新冠病毒檢測工作的順利實現。

以下是各項工作完成的時間節點：

2020年4月18日，通知下達后，院內任務布置，展開實地調研。

2020年5月31日，場地及設備配備到位，性能驗證完畢。

2020年6月4日，滿分通過上海市臨床檢驗中心審核，見圖6。

2020年6月5日，靜安區辦理核酸登記。

2020年6月10日，拿到實驗室備案憑證。