液相色譜法檢測糕點中五種合成著色劑的條件優(yōu)化

□ 唐曉偉 晏銳銳 胥 晶 濟南海關(guān)技術(shù)中心德州實驗室

糕點是生活中不可缺少的主要休閑食品，因其香甜的口感、別致的外形受到人們尤其是小朋友的喜愛。2019 年，全國糕點行業(yè)收入3 800 億元，其中針對幼年群體的產(chǎn)品份額達到1 344 億元，總比達到35.4%。隨著糕點行業(yè)的快速發(fā)展，一些商家為了在外觀口感上出新，追求靚麗的造型，人為加入某些人工合成著色劑。與天然色素相比，人工合成類著色劑具有價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、色彩艷麗等優(yōu)點。然而，合成類著色劑多以石油化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、硝化等反應(yīng)后得到的[1]，本身帶有一定的毒性。長期超量食用，會影響兒童神經(jīng)系統(tǒng)及骨骼的發(fā)育。目前，合成類著色劑的檢測標準為GB 5009.35—2016。該標準樣品范圍并未包含糕點[2]，且國家對糕點類人工著色劑的使用限量未做明確要求。本文以GB 5009.36—2016 為參考，對糕點中常用的檸檬黃等5 種合成著色劑建立液相色譜法檢測方法，已取得滿意結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

樣品采用蜜餞類糕點，該糕點基質(zhì)復(fù)雜，油脂、蛋白質(zhì)、淀粉含量較高。

1.2 實驗儀器

高效液相色譜儀（島津LC—30A，配紫外檢測器），電子天平（0.001 g，賽多利斯），高速離心機。

1.3 試劑耗材

檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅與日落黃5 種標準物質(zhì)（海岸鴻蒙，濃度均為1 000 mg/L）,乙酸銨（優(yōu)級純），磷酸氫二胺（優(yōu)級純），乙酸鋅（優(yōu)級純），亞鐵氰化鉀（優(yōu)級純），甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），聚酰胺固相萃取柱（dikma，150 mg/6 mL）。

1.4 儀器條件

檢測波長430、483、510 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

2 試驗方法

2.1 前處理方法

稱取5 g 樣品（精確至0.001 g），加入25 mL 提取液（乙醇∶乙腈=2 ∶1）， 震 蕩 提 取20 min 后，8 000 r/min 離心5 min，放置冰箱冷藏60 min，移取提取液5 mL，在40 ℃水浴條件下氮吹近干，加入3 mL 甲醇溶解待用。

2.2 過柱步驟

活化：依次用5 mL 甲醇、5 mL 10%甲酸水活化；上樣：加入待凈化液，棄去流出液；淋洗：加入5 mL 甲醇，棄去流出液；洗脫：加入15%氨水甲醇溶液，收集流出液，在40 ℃條件下氮吹至干，用初始流動相定容至1 mL，供分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線與檢出限

用超純水將5 種合成著色劑分別配制成不同濃度的標準混合溶液,經(jīng)液相色譜儀進樣檢測，以標準溶液濃度為橫坐標，相應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到5 種合成著色劑的標準工作曲線；以3 倍噪聲比確定最低檢出限。回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

表2 標準曲線回歸方程

3.2 檢測波長的選擇

根據(jù)標準物質(zhì)光譜圖（圖1）得，5 種著色劑的最佳檢測波長為：檸檬黃428 nm、莧菜紅521 nm、胭脂紅509 nm、誘惑紅509 nm 以及日落黃483 nm。為方便識別與計算，在實際檢測過程中采用如下波長：檸檬黃430 nm、莧菜紅胭脂紅誘惑紅510 nm、日落黃483 nm 進行檢測。

圖1 5 種合成著色劑的色譜圖

3.3 流動相的選擇

本次研究采用了（a）0.02 mol/L 乙酸銨—甲醇、（b）0.05 mol/L 磷酸氫二銨—甲醇、（c）0.05 mol/L 磷酸氫二銨—乙腈、（d）0.02 mol/L 乙酸銨—乙腈流動相體系。結(jié)果表明，b、c 體系中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅不能出峰，日落黃、誘惑紅出峰但響應(yīng)很低。a、d 體系中5 種目標物均能完全出峰，響應(yīng)值良好。但是在a 體系中胭脂紅、日落黃、誘惑紅響應(yīng)時間間隔較近，易受到雜峰干擾。對于極性物質(zhì)乙腈的溶解洗脫能力比甲醇強，且在實際進樣過程中乙腈體系柱壓比甲醇體系小15%，對色譜柱損耗較小，因此采用0.02 mol/L 乙酸銨—乙腈體系進行洗脫。

3.4 流動相梯度選擇

研究中試用了等度和梯度兩種洗脫程序。在等度洗脫中，壓力穩(wěn)定，基線平衡性好，但是胭脂紅、日落黃、誘惑紅3 個目標峰出現(xiàn)了連峰情況。此外，5 個目標峰出峰時間較長，完成進樣需要27 min。在梯度洗脫中，5 個目標峰峰形良好且彼此獨立。流動相濃度的變化會引起基線漂移，但不影響定量計算，在可接受范圍內(nèi)。經(jīng)過優(yōu)化，確定了2.4 中的洗脫程序，進樣時間共計15 min。

3.5 凈化條件的選擇

糕點中主要的干擾物質(zhì)為脂肪、蛋白質(zhì)及淀粉等，首先采用沉淀劑凈化的方法。在研究中試驗了常用的3種沉淀劑：①乙酸鋅—亞鐵氰化鉀；②15%三氯乙酸[3]；③硫酸鋅—氫氧化鈉。沉淀離心后，取上清液過柱定容，上機檢測。結(jié)果表明，②體系僅對蛋白質(zhì)有沉淀作用，對淀粉類物質(zhì)無凈化作用，處理后樣液渾濁，雜質(zhì)較多，不能進行上機分析的操作。①和③體系對樣品凈化作用較好，樣液澄清。但回收率較低，尤其是檸檬黃和莧菜紅，回收率不到30%。兩種體系均是利用鹽析反應(yīng)使蛋白質(zhì)變性沉淀，在此過程中鹽對目標物可能具有吸附作用。在兩種體系樣品離心后產(chǎn)生的沉淀中，均發(fā)現(xiàn)帶有目標物。因此沉淀劑凈化方法不適用。

乙醇具有能使蛋白質(zhì)變性沉淀的特點，同時淀粉、脂肪不溶于乙醇和乙腈。經(jīng)過多次改良，最終確定乙醇∶乙腈=2 ∶1 作為樣品提取液，濃縮后過柱凈化的處理方法。

4 目標物回收率

本次試驗采用三水平六平行的加標驗證模式。3 組加標濃度5、10、40 mg/kg，每組做6 個平行樣。平均回收率見表3。

表3 目標物回收率

5 樣品檢測結(jié)果

本實驗的檢測對象蜜餞中未檢出這5 種合成著色劑，為合格樣品。

6 結(jié)論

本方法以國家標準GB 5009.35—2016 為參考，建立了糕點中5 種常用合成著色劑的液相色譜法檢測流程，并對凈化方法、儀器條件進行了探索性驗證，最終確立了以乙醇∶乙腈=2 ∶1 作為樣品提取液，過柱凈化，梯度洗脫的檢測體系。目標物檢出限符合當(dāng)前市場質(zhì)檢需求，回收率在90%～110%，符合要求。針對含油量較高的樣品，建議在離心后將樣液放置在4 ℃冰箱中冷藏1 h，使脂肪在上層凝結(jié)析出，取中層樣液過柱，提高凈化效率。