自毒物質對羥基苯甲酸降解細菌ZH2的分離與應用

肖蓉 鄧舒 趙菁 張春芬 聶園軍 曹秋芬

摘要：自毒物質是造成植物連作障礙的主要因子，研究旨在篩選能夠降解土壤中自毒物質的細菌。采用選擇性分離方法從土壤中篩選自毒物質對羥基苯甲酸降解菌；結合形態特征、生理生化特征和16S rRNA測序鑒定菌種；采用紫外分光光度法測定菌株降解對羥基苯甲酸能力，并通過盆栽實驗驗證解毒效果。結果表明，分離到1株有降解對羥基苯甲酸能力的菌株，編號ZH2，經鑒定為綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）。在純培養條件下，當對羥基苯甲酸濃度為5 mg/mL時，ZH2能在培養72 h時將其降解97%。盆栽條件下，當基質中對羥基苯甲酸濃度為10 mg/g時，ZH2能有效緩解對羥基苯甲酸對黃瓜的生長抑制作用。該研究從土壤中分離到能夠降解對羥基苯甲酸的綠針假單胞菌，具有應用于連作障礙防控的潛在價值。

關鍵詞：對羥基苯甲酸；自毒物質；綠針假單胞菌；連作障礙；降解

中圖分類號：S60文獻標志碼：A論文編號：cjas2020-0115

An Autotoxicity p-Hydroxybenzoic Acid-degrading Strain ZH2： Isolation and Application

Xiao Rong1， Deng Shu1， Zhao Jing2， Zhang Chunfen1，Nie Yuanjun3， Cao Qiufen2（1Pomology Institute， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， Shanxi， China； 2College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， Shanxi， China； 3College of Economics and Management， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， Shanxi， China）

Abstract： Autotoxicity is the main factor causing obstacles to continuous cropping plants. The aim of the study is to screen bacteria from soil which can degrade autotoxicity. A selective screening method was used to screen p-Hydroxybenzoic acid （PHBA） degradation bacterium. Bacterial species were identified by combining the morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequencing results. The ability of the strain to degrade PHBA was determined by ultraviolet spectrophotometry. The effect of detoxification was verified by a pot experiment of cucumber. The results showed that one degradation strain（No. ZH2） was isolated and identified as Pseudomonas chlororaphis. On the condition of pure culture， ZH2 could degrade 97% at 72 h under 5 mg/mL PHBA concentration. In potted conditions， when the concentration of PHBA in the substrate was 10 mg/g， ZH2 could effectively alleviate the growth inhibition of PHBA on cucumber. We report a Pseudomonas chlororaphis strain screened from soil can degrade PHBA， it has the potential value of controlling continuous cropping obstacles.

Keywords： p-Hydroxybenzoic Acid； Autotoxicity； Pseudomonas chlororaphis； Continuous Cropping Obstacle； Degradation

0引言

化感作用（allelopathy）是指植物向環境釋放某些化學物質而影響自身或其他植物生長發育的化學生態學現象。一些化感物質能對下茬同種/科植物生長產生抑制作用，因此也被稱為自毒物質（autotoxicity）[1-2]。大量研究已經證實，對于大棚常見的蔬菜、瓜果來說，酚酸類物質是占比最大的自毒物質[3-7]，其中對羥基苯甲酸（p-Hydroxybenzoic acid，PHBA）在草莓和黃瓜根系分泌物中占比最大，毒性很強[8-10]。

在自然界中存在多種對酚酸類物質有降解作用的菌株，利用它們來降低農作環境中自毒物質的含量，是一條安全環保的途徑。祁國振等[11]從蘋果根際土壤中篩選到5株對蘋果根際自毒物質焦性沒食子酸、鄰苯二甲酸、根皮苷以及對羥基苯甲酸有降解能力的菌株；黃園勇等[12]從根際土中分離到29株對蘋果根皮苷有降解功能的放線菌；毛寧[13]也獲得了2株能夠降解土壤中草莓自毒物質對羥基苯甲酸和苯甲酸的放線菌；王曉輝等[14]從秦嶺土及西北極端生境中篩選到24株能夠降解西瓜自毒物質阿魏酸的放線菌；另外還有能夠降解西瓜自毒物質肉桂酸的微小桿菌（Exiguobacterium sp.）、能夠降解花生根際自毒物苯甲酸的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）、耐堿納西桿菌（Naxibacter alkalitolerans）[15-16]。盡管前人們已報道了這么多有降解效果的菌株，但大多數都還處于室內研究狀態，而且由于大田環境的復雜性和多樣性，每株菌有其自己的最適生長條件，其在實際使用中的修復效果也不同，因此繼續篩選自毒物質降解菌仍然十分重要。

本研究從土壤中篩選能夠降解自毒物質對羥基苯甲酸的菌株，通過形態學特征、16S rRNA基因序列分析和生理生化特征對其進行鑒定，并對其在純培養條件下的對羥基苯甲酸降解效率、溫室盆栽條件下的毒害緩解效果進行探究，為將該菌株開發成重茬土壤生物修復劑提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

土壤樣品采自山西太原陽曲縣（38°03′33.58″N，112°40′22.51″E）大棚草莓、黃瓜根際和重慶市忠縣某竹林（30°18′5.07″N，108°02′15.61″E）3種生境。供試黃瓜品種名為：‘新四號’，山東泰安華益種業有限公司。

對羥基苯甲酸、硫酸銨、七水硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈣、氯化鈉、蛋白胨、酵母粉均為分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒：北京Tiangen公司；PCR引物（27F和 1492R）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列為：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。盆栽基質為莘縣魯源育苗基質有限公司市售成品基質。

所用儀器：恒溫水浴搖床（HH-2J），金壇市杰瑞爾電器有限公司；光照培養箱（MLR-350），SANYO；掃描電鏡（日本電子，JSM-IT300LA）；紫外/可見分光光度計，eppendorf。

培養基：無機鹽基礎培養基：硫酸銨2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，磷酸二氫鈉0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，氯化鈣0.1 g/L，pH 7.2。在無機鹽基礎培養基中添加3 mg/mL對羥基苯甲酸即為選擇性培養基；LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.2[17]。試驗于2017—2019年在山西農業大學果樹研究所和山西農業大學生命科學學院（龍城校區）進行。

1.2方法

1.2.1對羥基苯甲酸降解菌的選擇性分離稱取5 g新鮮土樣，置于50 mL液體選擇性培養基中，于30℃，180 r/min條件下恒溫搖床振蕩培養。一周后取1 mL培養液用無菌水梯度稀釋，分別取10-6、10-7、10-8濃度的稀釋液0.2 mL均勻涂布在固體選擇性培養基上，30℃，黑暗條件倒置培養。7天后，挑取較大的菌落，在新的固體選擇性培養基平板上劃線培養，以獲得純菌株。純菌株保存在LB固體培養基上，供后續實驗使用。

1.2.2菌株鑒定參考《常見細菌系統鑒定手冊》[18]方法進行生理生化鑒定。菌株的分子鑒定參考[19]。將菌株的16S rRNA序列同時提交至NCBI和EzBiocloud[20]中進行比對，采用MEGA10.1軟件對菌株序列及相關標準菌株序列構建系統發育樹（最大簡約法，bootstrap值：1000）。按謝家儀[21]所述方法制備樣品，在掃描電鏡下觀察菌株形態。

1.2.3菌株的對羥基苯甲酸耐受能力及降解能力用1.1中無機鹽基礎培養液配制對羥基苯甲酸標準液，濃度分別為：0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 mg/mL，在波長255 nm下測定吸光度，繪制標準曲線。取新鮮過夜培養的菌液，于4℃，5000 r/min條件下離心5 min，棄上清，用無菌水將菌體重懸至OD600為1（菌體數目約為2×108cfu/mL），將重懸液按2%的體積比接種到25 mL新鮮的含對羥基苯甲酸無機鹽基礎培養液中。對羥基苯甲酸濃度分別為0.1 mg/mL、1 mg/mL和5 mg/mL。接種后于30℃，180 r/min恒溫搖床中震蕩培養。分別于培養4、12、24、36、48、60、72、84、96 h取樣。一部分樣品用于測定OD600，另一部分樣品用于測定PHBA殘留量。

將1mL菌液樣品加入到無菌離心管中，10000r/min，室溫條件離心5 min后，取0.2 mL上清液以不加對羥基苯甲酸的無機鹽基礎培養液作參比，在波長255 nm下測定吸光度。根據標準曲線計算培養液中的對羥基苯甲酸殘留量。按公式（1）計算降解率。Xt指取樣時間為t時的PHBA降解率；C0指初始PHBA含量；Ct指取樣時間為t時的PHBA含量。

1.2.4菌株緩解對羥基苯甲酸對盆栽黃瓜的毒害先將菌株接種到LB培養基里過夜培養，然后于5000 r/min，4℃條件下離心5 min，收集菌體用無菌水重懸至OD600為1即為拌土用菌液。黃瓜種子于55℃溫水中浸種10 min后置于28～30℃培養箱中保濕催芽，然后播種于育苗缽中培養。待幼苗長到兩葉一心時選擇大小一致的幼苗移栽到10×10×8 cm規格的塑料營養缽中，每缽裝滅菌基質40 g，基質按表1進行拌土處理（對羥基苯甲酸先溶解到20 mL水里再均勻拌到基質里）；每盆移栽一株，每處理重復9盆。將營養缽置于光照培養箱（25℃光照18 h，20℃黑暗6 h）。當黃瓜進入初花期后結束實驗，每個處理隨機選取5棵植株進行各指標的測定。用皮尺測定株高（根基到生長點的長度），游標卡尺測定莖粗（子葉基部下胚軸處的直徑），用直尺測定最大葉片的長a（葉片基部到葉尖的長度）和寬b（葉片上部肩寬距離），根據公式（2）計算葉面積[22]。

2結果與分析

2.1對羥基苯甲酸降解菌的選擇性分離與鑒定

通過選擇性培養基富集培養后從土壤中篩選到1株能以對羥基苯甲酸為唯一碳源生長的細菌，命名為ZH2。該菌株在LB固體培養基上菌落呈圓形，紅色，有光澤，表面濕潤，不透明，培養24 h時直徑1～1.5 mm（圖1A、B），培養48 h可見橙色色素，并很快擴散到培養基里（圖1C），培養一周后，菌落發粘。在掃描電鏡下觀察ZH2細胞形態（圖1D），發現該菌菌體長約0.3～ 1.0μm，呈桿狀，單個生長，一端鈍圓，一端稍尖。ZH2部分生理生化特征見表2。

將ZH2菌16S rRNA序列（GenBank Accession No. MT410466）分別輸入到EZbiocloud和NCBI數據庫中進行序列比對（表3），結果表明，在2個數據庫中ZH2都歸屬于綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis），但在亞種歸屬上存在分歧。從EZbiocloud中獲取相關標準菌株序列構建ZH2的系統發育樹（圖2），可見ZH2與P. chlororaphis subsp. Aurantiaca和P. chlororaphis subsp. aureofaciens聚在同一個分支上，需結合其他方法確定ZH2的亞種地位。目前，該菌株已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No：14461。

2.2菌株的對羥基苯甲酸耐受能力及降解能力

根據不同濃度對羥基苯甲酸標準液對應的吸光度值做出標準曲線，擬合的方程式為：C（A） = 0.0155×A+ 0.0002。R2值為0.9988。

將ZH2培養在以不同濃度對羥基苯甲酸為唯一碳源的培養基中，其生長曲線和培養基中對羥基苯甲酸降解率見圖3。可見，在對羥基苯甲酸濃度很低時（0.1 mg/mL，圖3A），剛培養4 h，培養基中的對羥基苯甲酸已經被降解了80%，培養12 h時，對羥基苯甲酸被降解了97%，初始碳源幾乎消耗殆盡。從生長曲線來看，OD600值出現增長，但直到培養96 h時，OD值最高僅為0.293，說明由于體系中碳源濃度太低，ZH2并未大規模增殖。

當對羥基苯甲酸濃度增大至1 mg/mL時（圖3B），ZH2生長曲線表現出明顯的延緩期、對數期、穩定期和衰亡期。由于碳源相對充足，體系中ZH2在培養12h后出現明顯增殖，進入對數生長期，當培養至24 h時，OD值達到1.247，但隨后OD值開始下降。從降解曲線來看，體系中對羥基苯甲酸的降解與ZH2菌體的增殖密切相關。培養12 h前，由于菌體未大量增殖，體系中對羥基苯甲酸降解率很低。12 h后隨著細菌的大量增殖，對羥基苯甲酸降解率快速增大，24 h后降解率達70%，48 h后降解率達98%。

當對羥基苯甲酸濃度增大至5 mg/mL時（圖3C），從生長曲線可以看出，ZH2的生長延緩期明顯增長，最大OD值明顯增大，穩定期明顯縮短，衰亡速度明顯增快，說明5 mg/mL對羥基苯甲酸對ZH2有一定的抑制作用，ZH2需要更長時間的適應才能開始正常生長。但適應后，在充足的碳源條件下，ZH2得到充分的增殖（最高OD值達7.92）。但隨著初始碳源的降解，中間產物積累，其中一些中間產物可能會對ZH2產生毒害作用，導致ZH2快速進入衰亡期。從降解曲線來看，與圖3B一樣，體系中對羥基苯甲酸的降解與ZH2菌體的增殖密切相關。培養36 h前，對羥基苯甲酸未被降解；培養48 h時，降解過半；培養72 h時，降解率達97%。

2.3菌株緩解對羥基苯甲酸對盆栽黃瓜的毒害

對羥基苯甲酸和ZH2對黃瓜生長的影響見圖4，可見，當基質中含有10 mg/g對羥基苯甲酸時，黃瓜苗的生長受到負面影響，表現為株高、莖粗、真葉數量和最大葉片面積都比對照減小，其中葉面積差異顯著。當施加對羥基苯甲酸的同時添加ZH2菌液時，這種負面影響能夠減小，甚至生長情況優于對照，表現為株高、莖粗和真葉數量大于對照，但最大葉片面積仍小于對照。說明ZH2菌液不僅能夠緩解對羥基苯甲酸對黃瓜苗的毒害作用，而且能夠促進黃瓜苗生長。

3討論與結論

假單胞菌屬廣泛存在于土壤、水體及植物根際，由于其具有多種功能而被廣泛研究[23-25]。該屬菌株具有對植株生長的促進作用、對病原微生物的抑制作用以及對有機物的降解作用，是近幾十年來生物土壤處理的重點。在耕地資源有限的前提下，植物根際產生的自毒化感物質成為制約農業產業可持續發展的重要障礙，尤其是在重茬栽培系統中，自毒物質的積累嚴重影響植物的正常生長。假單胞菌屬在植物根際自毒物質降解方面表現突出。Guzik等[26]從活性污泥中分離到菌株P. putida N6，能夠利用許多種芳香物質，包括對羥基苯甲酸、苯酚、鄰苯二酚、香草酸、苯甲酸[26]。Fujisawa等[27]1968年也曾經報道菌株P. aeruginosa能夠降解對羥基苯甲酸。Chen等[28]從黃瓜根際土壤中篩選到一株能夠降解對羥基苯甲酸的P. putida CSYP1。但據筆者所知，關于綠針假單胞菌降解這類芳香酸的報道很少，只有Waechter-Kristensen等[29]1994年報告從封閉的西紅柿水培體系培養液中分離到能夠降解對羥基苯甲酸的菌株被鑒定為P. aureofaciens，當體系中濃度為50μmol/L時，72 h內對羥基苯甲酸降解了約40%。本研究分離的ZH2來源于土壤，能夠以對羥基苯甲酸為唯一碳源生長，在純培養條件下具有降解對羥基苯甲酸的功能。當體系中對羥基苯甲酸濃度為5 mg/mL時，72 h降解了約97%。

本研究中根據16S測序及部分生理生化結果顯示ZH2在種水平上屬于綠針假單胞菌，但在亞種分類上還不夠明確。這是由于綠針假單胞菌的3個亞種（P. chlororaphis， P. aureofaciens和P. aurantiaca）之間本來就十分相似，關于它們的分類歷史上曾經存在分歧。1989年前，此3株菌被認為是不同的種[30]，后來P. aureofaciens被認為是P.chlororaphis的亞種，而P. aurantiaca仍然認為是不同的種。然而Peix等[31]2007年通過幾乎完整的16S rRNA基因分析、DNA-DNA雜交實驗、脂肪酸分析和表型性狀分析結果表明，盡管3株菌之間有一些差異，但他們之間有密切的親緣關系，表型和分子數據支持將這3株菌歸類為P. chlororaphis的3個亞種。因此，ZH2在亞種水平上的分類還需要借助其他手段來確定。

關于綠針假單胞菌，前人有許多研究，但大多數文獻報道均與綠針假單胞菌能產生具有廣泛抗真菌活性的吩嗪類物質相關，能夠產生吩嗪的綠針假單胞菌能夠抑制植物病原微生物，被當作生物防治菌株來防治各種植物病害[32-35]。國內對綠針假單胞菌研究較多，其中最突出的是上海交通大學張雪洪教授課題組。他們從甜椒根際土壤中分離得到一株綠針假單胞菌株GP72，能夠產生吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxilic acid， PCA）和2-羥基吩嗪（2-hydroxyphenazine，2-OHPHZ），對辣椒疫霉、西瓜炭疽病、終極腐霉、水稻紋枯病菌、瓜果腐霉等具有好的拮抗作用。該菌株的應用效果得到了國際上的廣泛認可，已經申請了專利[36-37]。國外方面的研究也證實綠針假單胞菌能夠抑制植物病害，誘導植物的ISR和過敏反應[34-35]，有溶磷功能、能產生鐵載體、HCN和激素類物質，能順利定殖到各種植物根際[23，38]，能促進多種植物的生長并提高產量[39]。本研究主要關注ZH2對自毒物質的降解，還未在ZH2對植物病害的抑制方面做深入的研究。但Peix指出假單胞菌屬產生的橙色色素往往反映出吩嗪的產生[31，40]，本研究中，ZH2在LB培養基上培養24 h時即會產生明顯的橙色、可以擴散的非熒光色素，推測ZH2也會有廣譜抗菌功能，下一步我們將進行ZH2菌株的抗病潛力探索。同時，ZH2菌株降解對羥基苯甲酸的最佳條件及在大田的實際應用還需進行深入的研究。

綜上所述，本研究從土壤中篩選到能夠降解自毒物質對羥基苯甲酸的綠針假單胞菌ZH2，在純培養條件下，當對羥基苯甲酸濃度為5 mg/mL時，ZH2能在培養72 h時將其降解97%。盆栽條件下，當基質中對羥基苯甲酸濃度為10 mg/g時，ZH2能有效緩解對羥基苯甲酸對黃瓜的生長抑制作用。ZH2在重茬障礙生物防治中具有潛在的應用價值。

參考文獻

[1]鄭軍輝，葉素芬，喻景權.蔬菜作物連作障礙產生原因及生物防治[J].中國蔬菜，2004（3）：57-59.

[2]李敏，張麗葉，張艷江，等.酚酸類自毒物質微生物降解轉化研究進展[J].生態毒理學報，2019，14（3）：72-78.

[3]孫海兵，毛志泉，朱樹華.環渤海灣地區連作蘋果園土壤中酚酸類物質變化[J].生態學報，2011，31（1）：90-97.

[4]Bai R， Ma F， Liang D， et al. Phthalic acid induces oxidative stress and alters the activity of some antioxidant enzymes in roots of Malus prunifolia[J].JournalofChemicalEcology，2009，35（4）：488-494.

[5]吳玉光，肖強.蔬菜連作障礙的防控技術[J].中國蔬菜，2010（07）： 23-25.

[6]王曉輝，薛泉宏.阿魏酸降解放線菌的篩選及其降解與拮抗效果研究[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2011，39（12）：153-158.

[7]孫秀，王秀峰，魏珉，等.肉桂酸降解真菌的篩選及其降解液對黃瓜種子發芽的影響[J].園藝學報，2014，41（4）：765-772.

[8]甄文超，王曉燕，孔俊英，等.草莓根系分泌物和腐解物中的酚酸類物質及其化感作用[J].河北農業大學學報，2004（4）：74-78.

[9]kitazawa H， Asao T， Ban T， et al. Autotoxicity of root exudates from strawberry in hydroponic culture[J]. Jounral of Horticultural Science & Biotechnology， 2005，80（6）：677-680.

[10]吳鳳芝，黃彩紅，鄧旭紅.酚酸類物質對黃瓜幼苗養分吸收的化感作用[J].內蒙古農業大學學報：自然科學版，2007（3）：131-133.

[11]祁國振，毛志泉，胡秀娜，等.蘋果根際自毒物質降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[J].微生物學通報，2016，43（2）：330-342.

[12]黃園勇，周光明，尹國通，等.植物根際放線菌分離方法初探及根皮苷降解活性分析[J].南方農業學報，2013，44（1）：54-58.

[13]毛寧，薛泉宏，唐明.2株放線菌對土壤中苯甲酸和對羥基苯甲酸的降解作用[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2010，38（5）：143-148.

[14]王曉輝.西瓜自毒物質阿魏酸降解放線菌篩選及其降解效果研究[D].楊陵：西北農林科技大學碩士學位論文，2011：1-3.

[15]馬元元，陳向向，李敏，等.微小桿菌（Exiguobacterium sp.）對肉桂酸降解行為[J].微生物學通報，2017，44（9）：2079-2088.

[16]何志剛，汪仁，王秀娟，等.花生自毒物質降解菌的篩選及其降解效果初步研究[J].中國農學通報，2014，30（21）：224-227.

[17]中國林業微生物菌種保藏管理中心.中國林業菌種目錄[M].北京：中國農業出版社，2006：199.

[18]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社， 2001：349-398.

[19]肖蓉，王媛，聶園軍，等.基于高通量測序技術的鉻污染農田土壤菌群多樣性及修復菌株的篩選[J].應用與環境生物學報，2019，25（4）： 933-942.

[20]Ha S M， Kim C K， Roh J. Application of the whole genome-based bacterial identfication system， TrueBac ID， in clinical isolates which were not identified with three MALDI-TOF M/S systems[J]. Ann Lab Med， 2019，39（6）： 530-536.

[21]謝家儀，董光軍，劉振英.掃描電鏡的微生物樣品制備方法[J].電子顯微學報，2005（4）：440.

[22]裴孝伯，李世誠，張福墁，等.溫室黃瓜葉面積計算及其與株高的相關性研究[J].中國農學通報，2005（8）：80-82.

[23]Rovera M， Carlier E， Pasluosta C. Pseudomonas aurantiaca： plant growth promoting traits， secondary metabolites and inoculation response. In： Ahmad I， Pichtel J， Hayat S （eds） Plant–bacteria interactions. Strategies and techniques to promote plant growth. Wiley–VCH， Germany[J]. 2008：155-164.

[24]Kohler J， Caravaca F， Carrasco L， et al. Contribution of Pseudomonas mendocina and Glomus intraradices to aggregate stabilization and promotion of biological fertility in rhizosphere soil oflettuceplantsunderfieldconditions[J].SoilUse And Management， 2006，22（3）：298-304.

[25]楊光富，魏云林.假單胞菌研究現狀及應用前景[J].生物技術通報， 2011（01）：37-39.

[26]Guzik U， Gren I， Hupert- Kocurek K， et al. Catechol 1，2-dioxygenase from the new aromatic compounds - Degrading Pseudomonas putida strain N6[J]. International Biodeterioration & Biodegradation， 2011，65（3）：504-512.

[27]FujisawaH，HayaishiO.Protocatechuate3，4- dioxygenasecrystallizationandcharacterization[J].JournalofBiological Chemistry， 1968，243（10）：2673-2681.

[28]Chen S， Guo L， Bai J， et al. Biodegradation of p-hydroxybenzoic acid in soil by Pseudomonas putida CSY-P1 isolated from cucumber rhizospheresoil[J].PlantAndSoil，2015，389（1-2）：197-210.

[29]Waechter- Kristensen B， Sundin P， Jensén P. Degradation of phenolic acids by bacteria isolated from hydroponic tomato culture with circulating nutrient solution[J]. Acta Horticulturae， 1994（381）： 611-614.

[30]Skerman V， Mcgowan V， Sneath P. Approved lists of bacterial names[J]. International Journal of Systematic Bacterioloogy， 1980，30（1）： 225-420.

[31]Peix A， Valverde A， Rivas R. Reclassification of Pseudomonas aurantiaca as a synonym of Pseudomonas chlororaphis and proposal of three subspecies， P. chlororaphis subsp. chlororaphis subsp. nov.， P. chlororaphis subsp. aureofaciens subsp. nov.， comb. nov. and P. chlororaphis subsp. aurantiaca subsp. nov.， comb. nov[J]. Int J Syst Evol Microbiol， 2007（57）：1286-1290.

[32]Park J Y， Oh S A， Anderson A J. Production of the antifungal compoundsphenazineandpyrrolnitrinfromPseudomonas chlororaphis 06 is differentially regulated by glucose[J]. Letters in Applied Microbiology， 2011（52）：532-537.

[33]Mavrodi D V， Blankenfeldt W， Thomashow L S. Phenazine compounds in fluorescent Pseudomonas spp. Biosynthesis and regulation[J].Annual Review of Phytopathology， 2006，44：417-445.

[34]Pierson L S I， Pierson E A. Metabolism and function of phenazines in bacteria： impacts on the behavior of bacteria in the environment and biotechnological processes[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2010，86（6）：1659-1670.

[35]Jiao Z， Wu N， Hale L， et al. Characterisation of Pseudomonas chlororaphis subsp aurantiaca strain Pa40 with the ability to control wheat sharp eyespot disease[J]. Annals of Applied Biology， 2013， 163（3）：444-453.

[36]何延靜，劉海明，胡洪波，等.一株拮抗辣椒疫霉的假單胞菌的分離與鑒定[J].微生物學報，2006（4）：516-521.

[37]黃玲.綠針假單胞菌GP72中吩嗪抗生素的合成基因簇克隆與產量提高[D].上海：上海交通大學，2010：17.

[38]Rosas S， Rovera M， Andre S J A. In： Sorvari S， Toldo O （eds） Proceedingprospectsandapplicationsforplantassociated microbes.：1stInternationalconferenceonplant- microbe interactions：endophytesandbiocontrolagents[C].Lapland， Finland， 2005.

[39]Susana B R， Nicola？s A P， Lorena B G， et al. Efficacy of Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca SR1 for improving productivity of several crops[M]. Crop Production Technologies， InTech， 2012：199-210.

[40]Spencer M， Ryu C M， Yang K Y， et al. Induced defence in tobacco by Pseudomonas chlororaphis strain O6 involves at least the ethylene pathway[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2003，63（1）：27-34.