響應面法優化百香果中原花青素提取工藝研究

羅應，李彥青，涂睿，程昊，孔紅星，李利軍,

(1.廣西科技大學 鹿山學院，廣西 柳州 545616；2.廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006)

原花青素(PC)為生物類黃酮混合物，其分子結構獨特，具有較強的清除人體內自由基功效，為公認天然抗氧化劑[1-2]。在目前以植物提取原花青素的研究中，以葡萄籽為最佳原料[3]，同時藍莓[4]、油茶殼[5]、白刺果[6]、珊瑚樹葉[7]、蓮子殼[8]、紅樹莓籽[9]、鎖陽等[10]也存在原花青素。

百香果屬多年生熱帶藤本植物，富含人體必需的17種氨基酸及多種維生素、微量元素等，具有消炎止痛、活血降壓、醒酒、抗疲勞、增強免疫力、排毒養顏等保健作用，其果汁和籽可直接食用，果皮可提取果膠和醫藥成份，具有重要的食用和藥用價值。周菊英等利用百香果葉提取的粗多酚實現了較好的抗氧化活性和抑制α-葡萄糖甘酶的作用[11]；近期熊建華等探究表明，天然百香果中花青素穩定性較差，最佳提取工藝下，百香果中花青素提取率3.125 mg/g[12]。

本研究立足廣西百香果資源優勢，在前期相關研究基礎上進一步優化原花青素提取工藝，提高原花青素提取率。該研究以綠色安全的乙醇為溶劑，采用鐵鹽催化比色法(正丁醇-鹽酸法)對原花青素含量進行測定，以單因素法與響應面法相結合，對原花青素提取工藝進行優化，建立原花青素提取率與因變量的二次回歸模型方程，并確定其最佳提取工藝，以期為廣西百香果資源開發應用和原花青素提取提供一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

原花青素標準品，成都德銳可生物科技有限公司；十二水合硫酸鐵銨(Ⅲ)，Alfa Aesar；正丁醇、濃鹽酸、無水乙醇均為分析純；百香果，市售。

UV-2102PC紫外可見分光光度計；100～1 000 μmL 移液槍；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；皇代800Y粉碎機；UV-2102PC紫外可見分光光度計。

1.2 原花青素提取

取大小、色澤均一的新鮮百香果10顆，去除汁與籽，用粉碎機粉碎3 min(R=3×104r/min)，得百香果原料。準確稱取2 g百香果原料于有磁力攪拌子和回流裝置的單口100 mL反應瓶，按固液比 1∶15 g/mL 加入水-乙醇混合溶液，升溫至40 ℃，提取1 h，得原花青素提取母液。

1.3 原花青素檢測

1.3.1 鐵鹽催化比色法顯色劑溶液配制 鐵鹽催化比色法顯色劑溶液包括質量分數為2%的硫酸鐵銨溶液和正丁醇-鹽酸溶液，實驗方法參考文獻[13]。準確稱取1.029 8 g十二水合硫酸鐵銨(Ⅲ)，溶于4 mL的2 mol/L鹽酸中，得質量分數為2%的硫酸鐵銨溶液。另外，將正丁醇與2 mol/L鹽酸溶液按體積比V(正丁醇)∶V(鹽酸)=95∶5混合均勻，即得正丁醇-鹽酸溶液。

1.3.2 原花青素測定 原花青素經熱酸處理后，由無色轉變為深紅的花青素離子，用紫外-可見分光光度法測定原花青素含量。

取10 mL比色管，分別加入1.0 mL樣品溶液、6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液和0.2 mL質量分數2%的硫酸鐵銨溶液，振蕩搖勻，于100 ℃下反應40 min；取出后置于冰水中冷卻至室溫，采用UV-2102PC紫外可見分光光度計為測試平臺，用正丁醇建立基線，于547 nm處測定樣品溶液的吸光值，以此實現對原花青素的有效測定。

1.3.3 原花青素標準曲線的建立 稱取50.0 mg的原花青素標準品于25 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線，然后混合搖勻，得2 mg/mL的原花青素標準品溶液。再以4 mL為基準，分別配制稀釋溶液質量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mg/mL的標準品稀釋液，于 547 nm 處測定各濃度的吸光值，建立吸光度對原花青素濃度的標準曲線。圖1表明在0.2～1.8 mg/mL范圍內，吸光值與原花青素質量濃度呈良好線性關系，其線性方程為：A=0.489 9C(R2=0.973)。

圖1 標準曲線圖Fig.1 Standard curve for proanthocynidins

2 結果與討論

2.1 反應溫度對原花青素提取率的影響

取百香果2 g，在乙醇體積分數70%，反應時間1 h、固液比1∶20 g/mL條件下，考察了反應溫度對原花青素提取率的影響，結果見圖2。

圖2 反應溫度對提取率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on theextraction rate of proanthocynidins

由圖2可知，原花青素提取率隨反應溫度升高呈先增加后減小趨勢，40 ℃時達最大值1.20%。溫度對反應體系萃取效果具有雙重效應，一方面，溫度升高有利于改善體系傳質效能，加大擴散系數，利于原花青素向溶劑中擴散，提高萃取率；另一方面，隨著萃取溫度升高，因原花青素對熱不穩定，導致提取率下降。所以，反應溫度以40 ℃為宜。

2.2 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

以40 ℃為最優溫度，乙醇體積分數對原花青素提取率的影響見圖3。

由圖3可知，乙醇體積分數過低或過高均不利于提高原花青素提取率，乙醇體積分數為50%時，原花青素提取率達到最佳值1.41%。這是由于作為多酚化合物，原花青素易溶于水和多數有機溶劑，當體系極性與原花青素極性相近時，更容易將其萃取出來。

圖3 乙醇體積分數對提取率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on theextraction rate of proanthocynidins

2.3 固液比對原花青素提取率的影響

在最優反應溫度40 ℃，乙醇體積分數50%條件下，固液比對原花青素提取率的影響見圖4。

圖4 固液比對提取率的影響Fig.4 Effects of the volume of extractant on theextraction rate of proanthocynidins

由圖4可知，原花青素提取率呈先增加后降低，固液比1∶15 g/mL時,原花青素提取率達最佳值1.52%。

2.4 反應時間對原花青素提取率的影響

在上述工藝優化基礎上，由圖5可知，反應時間過短，原花青素不能充分擴散到溶劑中，使體系萃取效果不完全；當反應時間過長時，原花青素分解量增加，也不利于其產率提高。反應時間為60 min時，可實現對百香果中原花青素的有效萃取。

圖5 反應時間對提取率的影響Fig.5 Effects of reaction time on the extractionrate of proanthocynidins

2.5 原花青素提取工藝響應面優化

2.5.1 模型建立及顯著性檢驗 在單因素優化基礎上，選取反應溫度為40 ℃，以乙醇體積分數、反應時間及固液比為變量，以原花青素提取率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件，依據Box-Behnken實驗設計原理設計3因素3水平響應面實驗，因素水平見表1,結果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels graph

表2 響應面實驗結果Table 2 Results of the response surface methodology

利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結果進行擬合，原花青素提取率=1.55-0.034A+0.071B+0.011C+0.20AB-0.14AC+0.062BC+0.064A2-0.031B2- 0.20C2，方差分析見表3。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

由表3可知，該回歸模型Prob=0.004 3，表明該二次回歸方程模型高度顯著，且失擬項Prob=0.125 6，說明該方程對實驗擬合較好；同時B、AB、AC、C2對原花青素提取率的影響是顯著的。

2.5.2 響應面分析與優化 利用Design-Expert 8.0.6軟件對乙醇體積分數、反應時間、固液比3因素間的交互作用進行響應面法分析，繪制出以原花青素為響應值的響應面3D曲線圖。依據3D曲線圖中各因素對應曲線陡峭趨勢，可直觀判斷出該因素對原花青素提取率影響程度。從圖6(a)、6(b)可以看出，當乙醇體積分數較大時,反應時間延長有利于提高原花青素提取率；圖6(c)、6(d)表明當乙醇體積分數一定時原花青素提取率隨固液比增加先增加后減小；同樣，當反應時間不變時，圖6(e)、6(f)中原花青素提取率也隨固液比增加呈先增大后減小趨勢。

由各響應面3D圖可知，響應值存在最大值。利用Design-Expert 8.0.6軟件，在實驗因素范圍內選擇最低點為出發點，響應值選擇最大值優化，優化得到原花青素提取率的最佳理論工藝為：乙醇體積分數55%，反應時間70 min，固液比14.6 g/mL及反應溫度40 ℃，該條件下原花青素提取率為1.83%。

圖6 兩因素交互作用對提取率影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour pots for the effects of operating parameters on the extraction rate

2.5.3 響應面法的可靠性 為驗證該模型的可靠性，選取乙醇體積分數55%,反應時間70 min,固液比1∶15 g/mL及反應溫度40 ℃，作3次平行實驗，得原花青素平均提取率為1.82%，與理論值吻合，表明基于響應面法優化原花青素提取工藝準確、可靠。

2.6 百香果籽原花青素提取研究

取洗凈、干燥好的百香果籽10 g，采用“1.2”方法對樣品進行處理，并準確稱取2 g百香果籽粉末，于響應面法最佳工藝條件下進行原花青素萃取，并與百香果皮原花青素提取效果進行對比，結果見圖7。

圖7 百香果皮、籽原花青素提取液吸光值對比圖Fig.7 Comparison of the absorptions of different extractsfrom passion fruit peel and seeds

由圖7可知，百香果皮原花青素提取液在 547 nm 處有明顯吸收峰，百香果籽原花青素提取液在500～600 nm之間沒有任何峰值，吸光度曲線呈逐漸降低趨勢，表明百香果籽原料萃取液不含原花青素。

3 結論

百香果皮原花青素提取最佳工藝為：反應溫度40 ℃，反應時間70 min，固液比1∶15 g/mL及乙醇體積分數55%，該條件下原花青素提取率可達1.82%，即質量分數為18.2 mg/g，與現有文獻原花青素提取率3.125 mg/g相比，該工藝對原花青素萃取效果顯著。同時，該工藝下百香果籽中不含原花青素。