穩定性微酸次氯酸消毒液發生器的消毒效果研究

王晨杰，薛源，張鑫，于萍，羅運柏

(1.武漢大學 化學與分子科學學院 有機硅化合物與材料教育部工程研究中心，湖北 武漢 430072；2.解放軍第960醫院,山東 濟南 250031；3.中天恒安(北京)科技有限公司，北京 100000)

次氯酸鈉是一種能以任意比例與水互溶的含氯消毒劑，溶于水中可生成新生態氧和次氯酸，HClO的強氧化性是NaClO溶液能夠高效殺菌的主要因素[1-2]。研究表明，HClO的濃度與溶液的pH值密切相關[3-4]，當pH值在5～7的范圍內時，HClO的含量達90%以上[5-7]。一般稀釋后的次氯酸鈉溶液呈堿性，溶液中殺菌能力較弱的ClO-離子的含量占大多數，而HClO的殺菌能力大約是ClO-離子的80倍[8-9]。因此將NaClO溶液的pH調至微酸性，HClO的濃度會極大地增加，溶液的殺菌能力顯著增強。

本文設計了一臺小型穩定性次氯酸消毒液發生器，通過調整成分含量和添加穩定劑，生產出具有穩定性的微酸性HClO溶液，并對該消毒液發生器的消毒效果、穩定性效果以及滅菌機理進行了研究。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

白色念珠菌(CICC 31284)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸桿菌(CICC 10899)均由中國工業微生物菌種保藏中心提供，菌種代數均為第三代；營養肉湯培養基和營養瓊脂培養基均為人工配制；胰蛋白胨、氯化鈉、次氯酸鈉、稀鹽酸、牛血清白蛋白、硅酸鈉、碳酸氫鈉、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、多聚甲醛、乙醇、乙酸異戊酯、硫代硫酸鈉、吐溫-80、重鉻酸鉀、碘化鉀、可溶性淀粉、濃硫酸均為分析純。

BCN-1360型生物操作臺；KF63-DHP9162B電熱恒溫培養箱；DZ11-2恒溫水浴鍋；AE224電子天平；BV01-90-2恒溫磁力攪拌器；BXM-30高壓滅菌鍋；GT10-2離心機；Merlin Compact SEM掃描電子顯微鏡。

1.2 菌懸液制備

將白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌增菌培養后在營養瓊脂斜面接種其中的典型菌落，在37 ℃恒溫條件下培養24 h。用胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)輕輕洗滌營養瓊脂斜面培養物，并稀釋成細菌懸浮液。實驗時，將有機干擾物(30 g/L牛血清白蛋白溶液)加入其中，作等半稀釋，以制備實驗所需的細菌懸浮液。

1.3 微酸性次氯酸消毒液的制備

穩定性次氯酸消毒液發生器結構見圖1。

圖1 穩定性次氯酸消毒液發生器示意圖Fig.1 Schematic diagram of stable hypochlorous acid disinfectant generator1.裝置本體；2.消毒液生成器主柜；3.消毒液生成器副柜；4.酸化水混合罐；5.pH電極與射流器；6.NaClO原液罐；7.自來水導管；8.鹽酸稀釋液罐；9.消毒液儲存罐；10.出液導管；11.主柜內艙；12.穩定劑添加罐；13.射流器

組裝完成后即可生產出穩定性次氯酸消毒液進行消毒實驗，也可以與其他水處理單元串接使用。采用有效氯含量為60 g/L的NaClO溶液和質量分數為2%的鹽酸作為主要原料，生產出穩定的微酸性HClO消毒液需要經過3道工序：第1道工序為接通自來水，分別將NaClO溶液和鹽酸溶液進行稀釋，并經過充分混勻后，進入第2道工序；第2道工序將已經充分稀釋的兩種溶液進行攪拌混合，使兩者之間充分發生反應后進入第3道工序；第3道工序在混合液中加入穩定劑再次充分混合，即可產出有效氯含量為40～600 mg/L的穩定微酸性次氯酸消毒液。另外，在發生器中獨立設置了在線pH電極和穩定劑添加罐，通過pH電極的檢測防止酸添加過量導致氯氣的產生，提高該生產工藝的安全性。

有效氯含量測定根據《消毒技術規范》[10]中規定的碘量法分別在不同反應條件下取樣進行。發生器工藝流程見圖2。

圖2 穩定性次氯酸消毒液發生器工藝流程圖Fig.2 Process flow chart of stable hypochlorousacid disinfectant generator

1.4 實驗方法

1.4.1 中和劑鑒定實驗 以金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為實驗菌，按照中和劑懸液定量鑒定程序，設定6組平行實驗。作為實驗結果，當第1組無細菌生長或細菌數遠小于第2組，第2組中的菌落數超過5 cfu/mL，第3，4，5組內的菌落數相對誤差率≤15%，第6組沒有細菌生長時，實驗重復3次，統計平均值，若結果一致，表示所用中和劑符合實驗要求。

1.4.2 懸液定量殺菌實驗 將由發生器產出的消毒液于20 ℃恒溫5 min，取無菌試管向其中加入0.5 mL細菌懸浮液，再加入0.5 mL濃度為30 g/L的牛血清白蛋白溶液和4.0 mL消毒液(使用TPS作為陽性對照)，充分混勻。在反應至達到設定時間后，取0.5 mL上述混合物加入到含有4.5 mL中和劑的試管中，混合10 min后，適當稀釋接種并在37 ℃恒溫條件下培養。計算消毒液的殺滅對數值，實驗重復3次，取其平均值。

1.4.3 消毒液穩定性實驗 選擇硅酸鈉和碳酸氫鈉作為穩定劑，將不同含量的穩定劑加入到發生器直接產出的消毒液中進行實驗。分別稱取5 g上述兩種穩定劑于250 mL燒杯中，攪拌，使其完全溶解，移入500 mL容量瓶中，稀釋至刻度。取5個250 mL磨口玻璃瓶，分別加入200 mL 發生器產出的消毒液，設定5組平行實驗，固定硅酸鈉的量,改變碳酸氫鈉的含量。另外設置空白實驗組,不添加任何穩定劑。用碘量法測定在80 ℃條件下放置6 h后的有效氯的含量,選擇使有效氯含量降低最少的穩定劑組合，每組實驗重復3次，取其平均值。

1.4.4 消毒液對細菌表面形態的損傷 將有效氯含量為80 mg/L的消毒液處理之前和之后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞懸液在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，然后用1 mL PBS洗滌2次，棄去上清液。 將以上樣品在0.1 mol/L PBS的4%多聚甲醛溶液中重懸，并保持6 h。細菌細胞用30%，50%，70%，80%，90%和100%乙醇溶液連續脫水，并在每種溶液中處理15 min。脫水后，將樣品浸入乙酸異戊酯/乙醇(1∶1，V/V)中5 min，然后浸入100%乙酸異戊酯中5 min。最后，將細胞在室溫下干燥。通過使用雙面膠帶將電池連接到大型SEM管上，涂上金鈀，使用掃描電鏡進行觀察。

2 結果與討論

2.1 中和劑實驗結果

實驗結果見表1。

表1 中和劑鑒定結果Table 1 Neutralizer identification results

由表1可知，采用5 g/L Na2S2O3+ 5 g/L吐溫-80的0.03 mol/L PBS溶液可以有效地中和250 mg/L有效氯的消毒液對實驗菌的后續殺菌作用，該中和劑以及作用后的反應物對實驗菌和培養基無不利影響。

2.2 發生器產出消毒液定量滅菌實驗

實驗結果見表2。

表2 發生器產出的消毒液對細菌的殺滅效果Table 2 Germicidal efficacy of disinfectant produced by generator on bacteria

由表2可知，用該發生器產出150 mg/L有效氯的產品作用5 min，金黃色葡萄球菌的殺滅對數值為5.26，大腸桿菌為5.78，白色念珠菌為4.21。

2.3 消毒液穩定性實驗

向發生器產出的消毒液中添加Na2SiO3和Na2-CO3，在80 ℃條件下放置6 h的穩定效果見表3。

表3 加入穩定劑Na2SiO3與Na2CO3的穩定效果Table 3 Stabilizing effect of adding stabilizers Na2SiO3 and Na2CO3

由表3可知，不加入任何穩定劑的空白對照組，有效氯含量下降了31.26%；加入15 mL Na2SiO3和20 mL Na2CO3的消毒液，有效氯含量下降僅為5.24%，極大地提高了消毒液的穩定性，延長其貯存時間，使其適用性更為廣泛。在200 g消毒液中加入0.3 g Na2SiO3和0.4 g Na2CO3作為復配穩定劑，可以有效地延長產出消毒液儲存時長。Na2SiO3和Na2CO3的加入可以使消毒液增粘、增稠，減少溶液分子間的碰撞，降低了消毒液在儲存時的活性，其中Na2CO3的加入還可以抑制反應器中由于酸性過高而產生的氯氣。

2.4 次氯酸消毒液對細菌表面形態的損傷

經過有效氯含量為80 mg/L的次氯酸消毒液處理5 min之后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表面超微結構的變化結果見圖3。

圖3 細菌表面超微結構觀察圖Fig.3 Ultrastructure of bacterial surfaceA.未經處理的大腸桿菌；B.次氯酸消毒液處理的大腸桿菌；C.未經處理的金黃色葡萄球菌；D.次氯酸消毒液處理的金黃色葡萄球菌

由圖3可知，未經處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞表現出完整且具有規則的形態(圖A，C)，經過次氯酸消毒液處理后，兩種細菌表面均出現明顯地收縮，部分細胞壁塌陷(圖B，D)。細胞表面不可逆轉的破壞可能是氯化過程中微生物失活的主要步驟，次氯酸消毒劑會破壞細菌的表面結構，在消毒過程中，位于細胞壁上的肽聚糖的N末端氨基酸可能被氧化，從而導致細菌形態發生變化[11]。綜上所述，次氯酸消毒劑確實通過引起嚴重的形態學損傷而氧化或滅活細菌細胞。

3 結論

設計的新型次氯酸發生器產出的消毒液具有良好地消毒效果。當產出消毒液有效氯含量為150 mg/L時，分別作用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌5 min，前兩者殺滅對數值>5.00，后者殺滅對數值>4.00，對細菌繁殖體具有良好的殺滅作用。該新型次氯酸發生器裝置另外安裝穩定劑添加罐，每200 g消毒液中加入0.3 g Na2SiO3和0.4 g Na2CO3作為復配穩定劑，使得產出消毒液的穩定性極大地提升，可以有效地延長產出消毒液儲存時長。消毒液作用于細菌后對細菌表面形貌造成嚴重損傷，細菌表面出現明顯的裂解與破損，從而起到消毒滅菌的作用。

該新型次氯酸發生器可以連續生產出微酸性的次氯酸消毒液，在裝置中設置了在線pH電極來控制原料液的添加量防止產生氯氣，產出的消毒液具有穩定性強、殺菌能力強、安全無腐蝕等優點，適用于共公共衛生環境、食品加工、水處理等場景。