Treg細胞相關因子在重度慢性牙周炎中的表達

楊馨，王琳源，張文娟，張秀梅，高秀秋，關寧

(1.錦州醫科大學口腔醫學院；2.錦州醫科大學附屬第二醫院牙周黏膜科；3.錦州醫科大學基礎醫學院細胞生物教研室；4.錦州醫科大學附屬第一醫院腦與脊髓損傷重點實驗室，遼寧 錦州 121000)

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是一種由牙菌斑微生物引發的破壞牙周支持組織(包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質)的慢性炎癥性疾病[1]。因其發病早期臨床癥狀不顯著容易被患者忽視，就診時往往發展成為重度慢性牙周炎，出現牙齒松動或脫落。慢性牙周炎不僅是導致我國成人牙齒缺失的主要原因，而且與系統性疾病如動脈粥樣硬化、糖尿病、類風濕性關節炎等關系密切，影響人們的全身健康[2]。造成慢性牙周炎的病因有微生物因素、宿主易感性以及環境因素等，慢性牙周炎病因的復雜性決定了疾病治療的復雜性。雖然在臨床上采用機械性清除菌斑、牙周組織再生手術以及一些輔助治療措施在一定程度上控制和改善了病損區的牙周狀況[3-4]，但對于重度慢性牙周炎，如何有效控制炎癥進展，促進牙周組織修復仍是當前牙周研究的重點。近來越來越多研究證明慢性牙周炎是由宿主的免疫系統和牙菌斑中的微生物相互作用而產生的炎癥性疾病，宿主對抗牙周致病菌的免疫應答影響著慢性牙周炎的炎癥進展和組織損傷[5]。Treg細胞是一類具有調節功能的CD4+T亞群，在維持體內免疫耐受及調控抗原引發的免疫反應中發揮重要作用[6]。有關在重度慢性牙周炎中Treg介導的免疫應答情況尚未有相關報道。為此，在本研究中我們通過檢測重度慢性牙周炎患者病損組織中Treg細胞相關因子Foxp3和IL-10 mRNA和蛋白表達，研究Treg細胞在重度慢性牙周炎中的表達情況。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Marker(賽默飛公司，美國)；Foxp3抗體(Cell Signaling公司，美國)；IL-10抗體(Cell Signaling公司，美國)；β-actin(Bioss公司，中國)；羊抗兔二抗(EarthOx LLC公司，美國)；BCA蛋白測定試劑盒(鼎國昌盛公司，中國)；PVDF膜(GE公司，美國)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天公司，中國)；HiScript II One Step RT-PCR Kit(Vazyme公司，中國)；100 bp DNA Ladder Marker(TaKaRa公司，中國)；Trizol(ambion，中國)；Foxp3引物合成(鼎國昌盛公司，中國)；IL-10引物合成(鼎國昌盛公司，中國)；DEPC水(鼎國昌盛公司，中國)。

1.2 樣本采集和處理

收集2018年1月至6月期間，于錦州醫科大學附屬第二醫院牙周黏膜科就診并診斷為重度牙周炎，且無保留意義需要拔除的患牙15例，取患牙的牙齦組織作為實驗組。同期收集15例因埋伏阻生需要拔除的第三磨牙，取冠方覆蓋的健康牙齦組織作為對照組。

實驗組納入標準[7]：(1)探診深度>6 mm；(2)附著喪失≥5 mm；(3)牙槽骨吸收超過根長的1/2；(4)炎癥較明顯，可伴有牙周膿腫；(5)后牙有Ⅱ度或Ⅲ度根分叉病變。診斷為重度牙周炎的患者需要2顆及以上患牙具有上述前3項特征；如僅有2顆患牙，這2顆患牙須不相鄰，且至少位于不同象限。

健康對照組納入標準[8]：(1)探診深度<3 mm；(2)無附著喪失；(3)無牙槽骨吸收；(4)牙齦無炎癥，探針不出血。

患者排除標準：(1)近6個月內接受過牙周治療；(2)近6個月內服用抗生素，非甾體類抗炎藥和免疫抑制類藥物；(3)患有系統性疾病；(4)妊娠、哺乳期和正在服用避孕藥的女性；(5)吸煙。

1.3 RT-PCR檢測

1.3.1 RNA提取

Trizol法提取牙齦組織的RNA。紫外分光光度計測量RNA濃度及OD 值，樣本260/280 nm OD比值均在1.8～2.2，記錄總RNA 濃度，單位ng/μL。操作完成后，凍存于-80 ℃冰箱或直接進行PCR反應。

1.3.2 RT-PCR 反應

按照一步法反轉錄試劑盒(Vazyme，中國)配置25 μL反應體系，加入反應體系中RNA的量約為300 ng。反轉錄得到的cDNA進行PCR擴增。

引物設計：

Foxp3引物序列：

上游引物序列:5′-CAAGTGGCCCGGATGTGAGA-3′，下游引物序列5′- TGAGCGTGGCGTAGGTGAAAG-3′。擴增目的基因片段長度為440 bp。

IL-10引物序列：

上游引物序：5′-GACTTTAAGGGTTACCTGGGTTG-3′，下游引物序列：5′- TCACATGCGCCTTGATGTCTG-3′。擴增目的基因片段長度為112 bp。

以β-actin 為內參照物：

上游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT -3′，下游引物序列5′- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。擴增目的基因片段長度為285 bp。

引物均由北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。反應條件為94 ℃，5 min；35個PCR循環(94 ℃，30 s；72 ℃，1 min)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠分離，在凝膠成像系統內掃描后測量譜帶強度。

1.4 western-blot檢測

取出適量標本，室溫融化，加入150 μL裂解液，反復吹打以充分裂解細胞，用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，經蛋白定量后按20微克/孔行10%聚丙烯酰胺(10%SDS-PAGE)電泳并經濕式轉膜、洗膜、封閉后，取一抗稀釋液(TBST液)按照1∶1000稀釋Foxp3，IL-10抗體，4 ℃搖床過夜；洗膜后，再加入按照1∶10 000稀釋的二抗，室溫振搖孵育2 h，充分洗膜后，用ECL法顯色、曝光后測量X光膠片上條帶密度。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 RT-PCR結果

我們采用RT-PCR法檢測兩組牙齦組織中Treg細胞相關因子Foxp3和IL-10的mRNA的表達情況。結果顯示：Foxp3和IL-10的mRNA在健康牙齦組織和重度慢性牙周炎的病變牙齦組織中均有表達，并且重度慢性牙周炎組Foxp3和IL-10mRNA的表達水平高于健康對照組，差異顯著(P<0.01)，見表1、圖1、圖2。

表1 兩組中Foxp3、IL-10的mRNA表達及比較

N：健康對照組；P：重度慢性牙周炎組

圖2 牙齦組織中Foxp3、IL-10mRNA表達**P<0.01

2.2 western-blot 檢測結果

進一步，我們通過western-blot檢測牙齦組織中Foxp3和IL-10的蛋白表達情況。結果顯示：健康的牙齦組織有Treg細胞相關因子Foxp3和IL-10蛋白的表達。與健康對照組相比，重度慢性牙周炎組中Foxp3和IL-10的蛋白表達水平增高，差異顯著(P<0.05)，見表2、圖3、圖4。

表2 兩組中Foxp3、IL-10的蛋白表達及比較

N：健康對照組；P：重度慢性牙周炎組

圖4 兩組中Foxp3、IL-10的蛋白表達**P<0.01和*P<0.05

3 討 論

慢性牙周炎是最為常見的一類牙周疾病。根據牙周袋深度、結締組織附著喪失和骨吸收的程度分為輕度、中度和重度[9]。1990—2017年全球口腔疾病流行趨勢的調查研究發現全球未經治療的重度牙周炎發生率為79.0%，中國是重度牙周炎標準化治療需求最高的國家之一[10]。慢性牙周炎發病的關鍵因素是牙周病原體形成的生物膜引發并導致牙周組織局部出現大量炎癥介質為特征的免疫炎癥反應，造成牙周病原體和宿主之間相互作用的失衡狀態[11]。以往研究發現，慢性牙周炎患者牙齦組織與外周血中Treg細胞比例高于健康人群。提示Treg細胞在宿主體內的增殖與慢性牙周炎密切相關[12-13]。

Treg細胞可分為胸腺來源的自然Treg細胞(natual Treg，nTreg)和外周來源的誘導Treg細胞(induced Treg，iTreg)，部分CD4+胸腺細胞進行分化時，抗原呈遞細胞所呈遞的一些特異性抗原可誘導Foxp3分子產生，這類CD4+胸腺細胞分化產生的nTreg細胞表面可穩定持續表達Foxp3分子；外周幼稚T細胞受轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β的持續性刺激可分化為iTreg細胞，iTreg細胞表面Fopx3分子也可穩定持續表達[14]。在免疫穩態下，各器官中Treg細胞數量基本恒定，調控自身反應性T細胞活化與增殖，在確保自身免疫耐受的同時啟動有效的免疫防御機制；在炎癥反應中，T細胞受體(T cell receptor，TCR)介導的信號刺激引起Treg細胞增殖，發揮非抗原特異性免疫抑制作用，進而調控炎癥程度[15]。研究發現，人X染色體連鎖的先天免疫缺陷綜合征(immunodysregulation，polyendocrinopathy，and enteropathy，X-linked syndrome，IPEX)與Foxp3蛋白編碼基因突變有關，此外Foxp3蛋白及mRNA的表達情況還與銀屑病、類風濕性關節炎等自身免疫病密切相關，提示Foxp3在Treg細胞的免疫調節功能中發揮關鍵性作用[16]。在本研究中，重度慢性牙周炎患者牙齦組織Foxp3表達高于健康人群，提示Treg細胞在慢性牙周炎的病損牙周組織中功能增強，參與炎癥反應的免疫調控。

Treg細胞可通過分泌細胞因子IL-10、TGF-β等發揮免疫調節功能，其中IL-10是慢性牙周炎發病過程中的重要調節因子[17]。IL-10是參與感染調節過程的基本細胞因子，具有多效性，可來源于Treg細胞，調控Treg細胞的增殖，協助Treg細胞在慢性炎癥的初始階段抑制中性粒細胞和單核細胞激活并促進其凋亡，減少炎性細胞外滲，并可直接抑制輔助T細胞的作用，防止機體炎癥過度活化及出現自身免疫癥狀[18-19]。Jiayin[20]等人通過對比慢性牙周炎患者與健康者牙齦組織中IL-10的表達情況發現，慢性牙周炎患者牙齦組織中IL-10表達增高，這提示IL-10在慢性牙周炎進展中可能起重要作用。程培紅[21]等人在對慢性牙周炎患者進行基礎牙周治療后，菌斑微生物對牙周刺激減弱，IL-10表達水平持續升高，提示IL-10可能通過抑制促炎因子和趨化因子等炎性成分，為后續炎癥修復和組織再生奠定良好基礎，并在修復過程中起一定作用。與上述報道相一致，在本研究中我們發現Treg細胞相關因子IL-10在重度慢性牙周炎牙齦組織中的表達增高，提示Treg細胞通過分泌IL-10抑制牙周組織的炎癥進程，進而促進組織修復。

綜上所述，在重度慢性牙周炎的病損組織中，Treg細胞可能通過分泌抑炎性細胞因子IL-10參與炎癥反應的調控。值得注意的是，盡管在重度慢性牙周炎牙齦組織中Treg細胞介導的免疫反應增強，但牙周支持組織病損并未得到有效控制，分析可能的原因如下：一方面是重度慢性牙周炎的病損微環境中除抑炎性細胞因子IL-10之外，還含有其他促炎性細胞因子如IL-6、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α等，促炎因子的高水平表達可能抑制了Treg細胞對免疫穩態的維持作用，削弱了Treg細胞的細胞效能[22]。另一方面雖然牙齦組織中Treg細胞表達水平增高，但一部分活化增殖的Treg細胞可能尚未發育完全，不能有效控制病原體，同時病損牙周破壞較為嚴重，發育成熟的Treg細胞所發揮的效能不足以有效控制炎癥，導致炎癥進展[23]。