內翻型膝骨關節炎骨結構的形態學觀察

鄔波，柳椰，馬旭，王佳媛，王譯晗，焦遞進

(1.遼寧省骨關節病重點實驗室；2.沈陽市骨科醫院關節外科，遼寧 沈陽 110044)

膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床上最常見的關節慢性退行性疾病，臨床表現為關節持續性疼痛、畸形及功能障礙，嚴重影響生活品質[1-2]。隨著我國人口老齡化的不斷發展，膝關節OA的發病率逐年增加，但膝關節OA的發病因素和病程進展機制并未十分明確。長期以來，內翻型KOA的原發病因常被認為是軟骨細胞代謝異常、軟骨基質被破壞，但隨著對骨功能單位研究和認識的不斷深入，有學者提出不均勻沉降理論[3-4]，認為膝關節OA造成的內外翻是由于外側腓骨支撐導致疏松退變的脛骨平臺內外側不均勻沉降繼發膝關節力線內移或外移，而后越來越多的研究表明內翻型KOA的病理改變可能涉及整個骨軟骨結構，尤其是鈣化層和軟骨下骨，可能在內翻型KOA的發病和病情進程中發揮著重要作用[5]。本文采用組織學觀察及免疫組化的方法，對人的膝關節OA脛骨平臺的病理改變及成骨破骨活性異常進行研究，為進一步研究膝關節內翻的骨結構異常機制提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

新鮮脛骨平臺標本取自2017年5月至2019年5月在我院行人工全膝關節置換術的42例KOA患者，其中男16膝，女26膝，年齡63～85歲，平均76.3歲。病程6～22年，平均12.4年。所有患病膝關節均伴有內翻畸形。納入標準：(1)符合骨關節炎診斷標準，經保守治療不能緩解的嚴重膝關節疼痛；(2)膝關節功能受限影響行走，膝關節內翻畸形嚴重，常態膝距在5 cm以上的患者；(3)活動時有骨摩擦感；(4)膝關節晨僵時間≤30 min；(5)膝關節骨性肥大伴有骨質增生；(6)術中見脛骨平臺內側磨損較重，磨損至軟骨下骨質；外側磨損較輕，軟骨結構基本完好。排除標準：(1)不符合診斷及納入標準者；(2)合并嚴重器質性疾病者；(3)合并有類風濕性關節炎、感染、骨腫瘤和創傷等其他膝關節疾病者。所有患者均自愿捐贈標本，并簽署知情同意書，試驗經沈陽市骨科醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 影像學檢查

術前行影像學檢查，通過下肢全長片和正側位X線片觀察測量下肢力線和內翻角度。

1.2.2 大體觀察

獲取新鮮脛骨平臺標本，觀察其軟骨外觀、顏色、光澤度、完整度，有無軟骨磨損、軟化、潰瘍、裂隙和骨贅形成等。

1.2.3 組織學觀察

大體觀察后分別在脛骨平臺內、外側中央負重區取軟骨-軟骨下骨組織塊，共計84個標本，大小為1.2 cm × 0.6 cm × 0.6 cm，并自然分為兩組：內側磨損組和外側組。將標本置于10%甲醛溶液固定24 h，12%中性EDTA-2Na脫鈣1.5 m，經梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后作厚度為4 μm的連續切片。切片分別行HE染色和Masson染色(具體操作詳見說明書)，觀察兩組透明軟骨和軟骨下骨的病理改變情況。

1.2.4 免疫組化分析

采用免疫組化SP法對兩組石蠟切片進行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、SOX9轉錄因子和骨鈣素(OCN)免疫組化染色分析。切片脫水后，0.125%胰蛋白酶37 ℃下行抗原修復20 min，余下步驟按照SP-9001試劑盒說明操作，DAB顯色，脫水透明，中性樹膠封片。

免疫組化切片置于100倍Olympus顯微鏡下，隨機選取每例臨近潮線5個不重疊視野作圖像分析，測定陽性顆粒平均灰度值，取每張切片的均值作為每例的測量值，比較兩組TRAP、SOX9和OCN的蛋白表達情況。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 影像學檢查

X線片觀察內翻角度8°～22°，平均內翻角度為12.6°，見圖1。

圖1 下肢全長片及正側位X線片

2.2 大體觀察

所有標本均可見內側磨損組軟骨退變情況較外側組更為嚴重。內側磨損組軟骨平臺表面粗糙無光澤，多見軟骨下骨暴露，平臺邊緣多發骨贅形成；外側組相對軟骨表面平整，局部有光澤，無軟骨全層缺失，見圖2。

左側為內側磨損組，右側為外側組

2.3 組織學觀察

2.3.1 HE染色觀察

外側組鏡下觀察，軟骨層厚，軟骨細胞數量多且排列整齊，深層偶可見肥大細胞聚集，潮線完整且有復制趨勢，無血管越過潮線生長，少見裂隙形成，見圖3A；內側磨損組軟骨表面磨損嚴重，多發裂隙形成，軟骨層變薄，軟骨細胞數量少且排列紊亂，各層結構界限不清晰，潮線紊亂，血管越過潮線生長，軟骨下骨板異常增厚，見圖3B。

2.3.2 Masson染色觀察

外側組鏡下觀察，軟骨膠原藍染，軟骨下骨板紅染，軟骨細胞密集，可見部分退變軟骨從潮線升起紅色火焰狀突起使未鈣化軟骨出現紅染，見圖4A；內側磨損組可見軟骨膠原淺藍染，軟骨細胞疏松且紊亂，軟骨表層纖維化，軟骨下骨板紅染，潮線模糊不清，有較多血管翳從潮線通過，侵蝕破壞關節軟骨，見圖4B。

2.4 免疫組化結果分析

免疫組化陽性細胞呈黃棕色，陰性呈藍色。鏡下觀察結果顯示，TRAP、SOX9和OCN均在潮線下的軟骨下骨板表達，內側磨損組與外側組相比TRAP、SOX9和OCN表達均顯著增加，且差異具有統計學意義，見圖5?；叶葴y量結果見表1。

外側組 內側磨損組

外側組 內側磨損組

A：外側TRAP；B：內側TRAP；C：外側SOX9；D：內側SOX9；E：外側OCN；F：內側OCN(箭頭所指為蛋白表達陽性，箭頭數量大致顯示出表達量的多少)

表1 免疫組化染色灰度值

3 討 論

膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是老年人常見的退行性關節疾病。隨著我國老齡化的不斷發展，膝關節OA的發病率逐年增加，嚴重影響老年患者的生活質量，給社會帶來沉重的經濟負擔。膝關節OA的主要臨床表現為膝關節疼痛、腫脹、活動受限的緩慢進展，在KOA終末期可致關節功能障礙甚至殘疾[6-7]。膝關節OA患者晚期易出現膝屈曲內翻畸形，其主要特點為內側軟組織緊張，內側副韌帶及內側角半膜肌腱攣縮，脛骨內側平臺軟骨退變磨損[8]。膝內翻患者X線片可見關節周圍骨質增生、關節間隙變窄，脛骨平臺內外側骨質結構發生改變[9]。

正常關節軟骨為乳白色半透明狀，平滑且有光澤，不含有血管、神經和淋巴。軟骨由淺到深可分為4層，分別為淺表層、過渡層、輻射層和鈣化層，前3層統稱為透明軟骨[10]。軟骨下骨包括軟骨下骨板和骨小梁結構。長期以來，軟骨的退行性變化及異常代謝被認為是膝關節OA的始發病因，隨著對骨軟骨功能單位研究的不斷深入，發現關節軟骨退變與軟骨下骨重塑的協同作用在內翻型KOA進程中發揮著極其重要的作用[11-12]。包括輻射層、潮線、鈣化層及軟骨下骨板在內的各功能單位，不僅在結構上緊密相連，更在生物學功能上相互影響、相互依賴，鈣化層和軟骨下骨的病變不但加快了軟骨退變過程，甚至可能是內翻型KOA的始發原因[13]。

膝關節OA主要有3種臨床表現。一是關節間隙變窄，軟骨磨損，半月板被擠到關節囊的后側和外側；二是關節邊緣形成骨贅，起到保護、穩定關節的作用；三是通常伴有軟骨下骨硬化和骨囊腫，繼而發生骨破壞。SOX9是骨軟骨形成過程中的生物標志物，可以決定間質細胞向軟骨細胞的分化，其對軟骨的分化成熟具有重要的正向調節作用[14]。骨鈣素(OCN)由成骨細胞合成用于骨形成，并在骨轉換期間釋放到循環血液中。在早期骨關節炎中通過骨礦化增強使骨代謝被激活，因此OCN是成骨細胞分化的主要表型特征之一[15]。TRAP是破骨細胞的標志性指標，主要反映軟骨下骨破骨細胞變化情況[16]。在內翻膝患者的KOA進程中，股骨髁和脛骨平臺產生軟骨磨損，脛骨平臺發生骨囊腫及軟骨下骨硬化。本文檢測的這3種因子通過不同途徑解釋膝關節OA的各種臨床表現。

骨重建過程是通過成骨細胞與破骨細胞協同來完成的。成骨與破骨作用的變化均會影響軟骨下骨的微環境，進而影響骨性關節炎的發生[17]。本研究中，內側磨損組中TRAP的表達較外側組明顯增多，表明在骨重建的初始階段，軟骨下骨發生囊性改變，破骨作用增強，破骨細胞反應性增加。內側磨損組中SOX9的表達較外側組明顯增多，可能是由于在機械力學的刺激下，軟骨磨損增加，造成軟骨修復能力增強，人體機制試圖修復這種損傷，代償性的增加了SOX9的表達，進而導致內側磨損組的軟骨下骨板異常增厚，該結果與臨床觀察一致。內側磨損組中OCN的表達較外側組明顯增多，其反應機制可能與SOX9相似，機械力學磨損刺激下，為保護、穩定膝關節正常功能，體內合成大量成骨細胞進而形成骨贅。

綜上所述，本試驗結合組織學觀察和免疫組化分析，對比骨性關節炎內翻膝關節兩側的脛骨平臺，研究其病理改變及成骨破骨活性，證明了鈣化層和軟骨下骨與軟骨一樣，在內翻型KOA的發病和病情進程中發揮著重要作用，為進一步研究膝關節內翻的骨結構異常機制提供實驗依據。但本實驗也存在不足之處：缺少軟骨中各因子含量的測量，無法與鈣化層和軟骨下骨中該指標含量進行對比分析；未進行影像學分析，缺乏具體的組織形態計量學參數。以上不足有待在今后的實驗中進一步完善。