重組泛素樣特異性蛋白酶1在大腸桿菌中的表達條件優化與分離純化

張葉明，付正豪，陳云雨

(皖南醫學院藥物篩選與評價研究所，安徽 蕪湖 241000)

小分子泛素樣修飾蛋白質(small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)廣泛存在于各種真核細胞中，是一種通過結合賴氨酸側鏈起相關調節修飾作用的蛋白質，廣泛參與RNA轉錄、DNA修復、細胞周期調控及蛋白質轉運等[1-2]。目前研究表明SUMO還可以作為重組蛋白質表達的融合標簽和分子伴侶，促進重組蛋白質的折疊與可溶性表達，提高蛋白質的穩定性與生物學活性[3-5]。但重組蛋白質融合的SUMO標簽可以被泛素樣特異性蛋白酶1(ubiquitin-like specific protease 1，Ulp1)特異性識別并切割，高效獲得具有天然結構和良好生物學活性的目的蛋白質。

Ulp1來源于釀酒酵母，是由621個氨基酸殘基組成的蛋白質，含有2個結構域，一個是保守性弱的N-端結構域(1～432 aa)，另一個是C-端結構域(432～621 aa)，具有促進蛋白酶折疊作用。Ulp1的結構分析與蛋白質水解實驗證實，Ulp1的活性結構域為第403至621位氨基酸，其表現出與全長的Ulp1等同的酶切活性，能夠水解以α-氨基連接的SUMO融合蛋白質[6]。Ulp1在移除SUMO標簽時依賴SUMO空間結構而不是線性氨基酸序列，實現了高效地特異性切割。更重要的是，融合蛋白質切除SUMO標簽后，目的蛋白質的N端不含有多余的氨基酸，很好地保持了目的蛋白質的空間結構與生物學活性。本研究旨在優化Ulp1(403～621 aa)在大腸桿菌中的原核表達條件，再以親和層析法一步分離純化，從而高效制備Ulp1，為Ulp1在生物工程中的酶切應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 E.coli BL21(DE3)感受態細胞購自全式金公司；pET-28a載體由中國醫學科學院-北京協和醫學院藥物研究所林媛副研究員惠贈。

1.1.2 主要試劑 DNA標準分子量、蛋白質標準分子量、質粒提取試劑盒、NdeⅠ、XhoⅠ購自全式金公司；BCA(bicinchoninic acid)購自Thermo公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗小鼠IgG、小鼠抗組氨酸(histidine，His)標簽單克隆抗體購自Biosharp公司；卡那霉素、氨芐西林、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)購自Sigma公司；HisTrapTM層析柱購自Cytiva公司；HRP底物化學發光液購自上海天能科技有限公司；其他所用試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 儀器與設備 恒溫金屬浴(Coyote Biotech公司)；超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ公司)；細菌振蕩培養箱(上海知楚儀器有限公司)；高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；蛋白質電泳儀與轉膜儀(Bio-Rad公司)；瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；凝膠成像系統(上海Clinx公司)；AKTA Pure層析系統(GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 Ulp1原核表達質粒的構建與鑒定 GenBank檢索Ulp1(403～621 aa)基因序列，并在目的基因兩端分別加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點，由通用生物(安徽)有限公司進行基因片段合成。再將目的基因直接連接pET-28a載體中，構建重組質粒，以雙酶切法進行鑒定。

1.2.2 Ulp1的原核表達 將構建成功的重組質粒Ulp1-pET28a以冷CaCl2化學轉化法轉化到E.coli BL21(DE3)細胞中，后在37 ℃的LB固態培養基(含50 μg/mL卡那霉素)中過夜。隨機選取6個單菌落到5 mL LB液態培養基中，誘導Ulp1表達(30 ℃誘導10 h，IPTG濃度為1 mmol/L)。采用SDS-PAGE電泳方法分析Ulp1的表達情況。

1.2.3 Ulp1誘導時間的優化 37 ℃培養工程菌到OD60約為0.7時，誘導溫度設置為20 ℃，加入 IPTG(1.0 mmol/L)繼續培養。分別在2、4、6、8、10、12 h時間點等量收集菌體，通過 SDS-PAGE方法鑒定Ulp1表達量。分別設置誘導溫度為25 ℃和30 ℃，重復以上實驗，栓測分析結果，從而確定不同誘導溫度的最佳誘導時間。

1.2.4 Ulp1誘導溫度的優化 等量隨機采集20 ℃誘導10 h、25 ℃誘導8 h和30 ℃誘導6 h的菌落，采用超聲法裂解菌體，收集上清液與沉淀，以12% SDS-PAGE分析Ulp1的可溶性表達，從而確定Ulp1最佳誘導溫度。

1.2.5 IPTG誘導濃度的優化 將工程菌于37 ℃培養至OD600約為0.7 h，分別加入不同濃度IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)，30 ℃誘導6 h。等量收集菌體，以 SDS-PAGE分析不同IPTG濃度下Ulp1的表達量，并確定IPTG最佳誘導濃度。

1.2.6 飽和硫酸銨沉淀制備粗提液 工程菌以0.2 mmol/L IPTG于30 ℃誘導6 h，收集的菌體超聲法破碎，收集菌體裂解上清液。在100 μL上清液中分別加入10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%飽和硫酸銨溶液，4 ℃沉淀2 h。離心收集沉淀，以80 μL TBS(25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl pH 8.0)重懸，再以12% SDS-PAGE確定各不同飽和硫酸銨濃度中Ulp1沉淀量，確定飽和硫酸銨的最佳沉淀濃度。

1.2.7 Ulp1分離純化與鑒定 在上述實驗確定的最佳原核表達條件下，大量誘導工程菌，用30%飽和硫酸銨溶液沉淀菌體裂解上清液，制備粗提液。用適量A液(50 mmol/L 咪唑、0.5 mol/L NaCl、25 mmol/L Tris pH 8.0)重懸，制備粗提液。用0.5 mL/min的流速上樣以10倍柱床體積A液清洗和平衡的HisTrapTM層析柱。隨后按照參考文獻方法進行洗脫收集、分離純化[7]。以SDS-PAGE電泳檢測，經TBS透析后，再用BCA法分析。

將含有Ulp1(24 kDa)泳道的電泳膠轉膜，開展Western blot實驗。一抗為1∶2000稀釋的小鼠抗His標簽單抗，二抗為1∶4000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG，用HRP底物化學發光液顯影成像。

2 結果與分析

2.1 Ulp1原核表達質粒的構建

將合成的Ulp1基因克隆到pET-28a載體中，構建了重組質粒Ulp1-pET-28a，見圖1A。構建的重組質粒經NdeⅠ和XhoI雙酶切后，可獲得大小約657 bp的特異性片段，擴增的特異性片段與Ulp1預期大小基本一致，說明成功構建了重組質粒Ulp1-pET-28a，見圖1B。

A：重組質粒Ulp1-pET-28a的構建；B：重組質粒Ulp1-pET-28a的雙酶切鑒定

2.2 Ulp1的原核表達

重組菌經1 mol/L IPTG誘導培養后，隨機選取6株工程菌，以SDS-PAGE分析，實驗結果顯示在相對分子量為24 kDa位置均有明顯的目的蛋白質表達條帶，這與Ulp1理論分子量基本相符，說明Ulp1原核表達成功，見圖2。

1:陰性對照；2：蛋白質標準分子量；3～8：誘導的工程菌

2.3 確定Ulp1最佳誘導時間

工程菌經20、25和30 ℃誘導培養后，以SDS-PAGE分析Ulp1原核表達量。當誘導溫度為20 ℃時，Ulp1表達量在10 h時趨于表達量峰值，此時表達量約為35%，見圖3a。當誘導溫度為25 ℃時，Ulp1表達量在8 h時趨于表達量峰值，此時表達量約為33，見圖3b。當誘導溫度為30 ℃時，Ulp1表達量在6 h時趨于表達量峰值，此時表達量約為36%，見圖3c。

(a,b,c)Ulp1在20 ℃、25 ℃、30 ℃誘導時間的優化

2.4 確定Ulp1最佳誘導溫度

菌體分別在20 ℃誘導10 h、25 ℃誘導8 h和30 ℃誘導6 h后，采用超聲法裂解菌體，收集沉淀與上清液。SDS-PAGE實驗結果表明，20 ℃誘導10 h時，Ulp1在上清液中含量較少；25 ℃誘導8 h時和30 ℃誘導6 h時，Ulp1雖有部分包涵體表達，但上清液中Ulp1含量明顯增多，Ulp1以胞內可溶形式表達，見圖4。

1:蛋白質標準分子量；2：全菌蛋白質(30 ℃)；3：上清液(30 ℃)；4：沉淀(30 ℃)；5：全菌蛋白質(25 ℃)；6:上清液(25 ℃)；7：沉淀(25 ℃)；8：全菌蛋白質(20 ℃)；9：上清液(20 ℃)；10：沉淀(20 ℃)

2.5 確定IPTG最佳誘導濃度

菌體在30 ℃溫度下分別以不同濃度IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)誘導6 h，SDS-PAGE實驗表明，雖然IPTG濃度不斷遞增，但Ulp1表達量基本不變，故選擇0.2 mmol/L IPTG為最佳誘導濃度，見圖5。

1:陰性對照；2：蛋白質標準分子量；3～7：0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG

綜上所述，確定誘導溫度30 ℃、誘導時間6 h、IPTG濃度0.2 mmol/L作為Ulp1最佳原核表達條件。

2.6 Ulp1分離純化與鑒定

工程菌在30 ℃下誘導6 h，以不同濃度的飽和硫酸銨沉淀菌體裂解上清液，SDS-PAGE結果顯示，30%飽和硫酸銨沉淀時Ulp1大量沉淀，見圖6a。以30%硫酸銨沉淀上清液制備Ulp1粗提液，再用HisTrapTM層析柱分離純化。SDS-PAGE結果表明，純化的Ulp1經考馬斯量藍染色后，在預期分子量(24 kDa)位置均出現單一蛋白質染色條帶，見圖6b，說明Ulp1具有較高的純度，純度大于90%。Western blot表明，在預期分子量位置仍可呈現單一條帶，證實了Ulp1的正確表達，見圖6c。純化的Ulp1以BCA法定量，其濃度為1.0 mg/mL，經原核表達條件優化后，Ulp1表達量約為350 mg/L。

(A)飽和硫酸銨法沉淀Ulp1。1：蛋白質標準分子量；2：10%；3：15%；4：20%；5：25%；6：30%；7：35%；8：40%；9：45%；(B)Ulp1的親和層析。1:陰性對照；2：蛋白質標準分子量；3：全菌蛋白質；4：30%飽和硫酸銨沉淀樣品；5～6：純化的Ulp1條帶；(C)Western blot實驗鑒定Ulp1。1：蛋白質標準分子量；2：Ulp1條帶(24 kDa)

3 討 論

SUMO融合表達系統具有顯著提升重組蛋白質表達水平、促進目的蛋白質正確折疊和提高目的蛋白質可溶表達等優點，因而廣泛應用于容易錯誤折疊、有毒和難溶性蛋白質的表達。Ulp1可以特異性識別并切割SUMO標簽，與傳統的切割酶不同，Ulp1識別SUMO空間結構，特異性切割SUMO標簽C端的異肽鍵，且切割后的目的蛋白質氨基端不含多余的氨基酸，幾乎不影響目的蛋白質的生物學活性，因此高效制備高產量的Ulp1并應用于重組蛋白質的酶切具有重要的實踐意義。

大腸桿菌原核表達系統具有成本廉價、操作簡捷、表達量高等眾多優點，已成為制備重組蛋白質的首選方案[8]。外源蛋白質連接分子量較小的His標簽后，可方便重組蛋白的分析檢測和分離純化，因此本實驗在Ulp1(403～621 aa)的羧基端融合了pET-28a載體的His標簽，并以親和層析方法進行了Ulp1分離純化。優化原核表達條件是為了在簡單的實驗環境下最大量的表達目的蛋白。基于誘導溫度、誘導時間和IPTG濃度是影響外源蛋白質表達的重要因素[9-10]，本課題組開展了Ulp1原核表達優化實驗。結果顯示，溫度是影響Ulp1表達的重要因素。20 ℃誘導培養時，Ulp1在上清液中含量較少，這可能與低溫導致目的蛋白表達速度緩慢有關。25 ℃與30 ℃誘導培養時，大部分Ulp1表達為可溶形式，這可能是高溫增加了蛋白質正確折疊、促進了蛋白質可溶。在低溫環境下大腸桿菌發展緩慢，可通過延長誘導時間以促進目的蛋白的表達。菌體在30 ℃環境下培養時，Ulp1表達量隨著誘導時間的延長而逐漸升高，在6 h左右后表達量趨于平穩，表達量約為35%，最高表達量約為350 mg/L，不低于現有文獻報道[11]。另外，IPTG對Ulp1誘導效率很高，濃度為0.2 mmol/L時即可達到較好的誘導效果。故此確定0.2 mmol/L IPTG、30 ℃誘導6 h作為Ulp1在大腸桿菌中的最佳表達條件。

綜上所述，本研究成功進行了Ulp1原核表達條件的優化與分離純化，為Ulp1在生物工程中的酶切應用奠定了實驗基礎。