非洲豬瘟病毒檢測方法研究進展

宮 婷

（遼寧省桓仁縣農業農村局，遼寧 桓仁 117200）

非洲豬瘟簡稱ASF（African swine fever），是一種容易引起家豬或者野豬發生急性、熱性的傳染性疾病，其傳播途徑通過密切接觸而來，其病原名稱為非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV），被世界動物衛生組織（OIF）定性為必須報告的動物疫病，我國定性一類疫病[1]。在我國，首例被確診的非洲豬瘟是在2018 年8月，從此之后，非洲豬瘟已經蔓延到了全國多個省市自治區和直轄市，給我國養豬行業及配套產業帶來了非常嚴重的經濟損失，甚至影響到了市場的肉類供應。

目前，國際上針對此病還沒有研制出可以預防的有效疫苗，防控疫病的方法主要采取生物安全措施。針對ASF 做及時明確的病原學檢測可以有效的為制定各項防控措施提出指導，對于疫病防控實施效果評估提供有利的依據。文章將主要的病原學檢測方法進行了解析，為ASF 的防控工作以及研發高效可行的診斷技術提供了參考內容。

1 病毒分離

首先要從病豬身上采集血液、脾臟、淋巴結等組織樣本，在其樣本上接種諸如豬肺泡巨噬細胞這樣的原代細胞，ASFV 在這些容易受到感染的細胞中產生病變同時產生復制。如果在培養的細胞組織中注入豬紅細胞，那么絕大多數的ASFV 就會對紅細胞產生吸附的反應，這種包圍豬紅細胞的狀態有一個好聽的名字叫“玫瑰花環”。由于還有一部分的非洲豬瘟病毒株對于紅細胞不會產生吸附反應，如果在分離培養的組織中沒有出現吸附反應而是產生了細胞裂變，那么就要通過免疫熒光或者是PCR 的方式來對細胞進行確認，看看是否有非洲豬瘟病毒的存在；檢測中需要注意，免疫熒光和PCR 要傳代3-5 次成陰性反應才可以被認可為陰性。如果是首次爆發ASF 的地區，在通過PCR 或者免疫熒光等方法監測的結果都是陽性的話，就需要再進行紅細胞吸附反應的實驗來驗證[2]。

2 抗原檢測

2.1 免疫熒光法

免疫熒光法是ASF 的檢測方法之一，被世界動物衛生組織所推薦。這個方法是針對臟器涂片或者薄層冷凍切片等加入異硫氰酸熒光素來標記抗ASFV 特異性抗體，以此來實現檢測。這種檢測方法主要是針對不產生HAD 的ASFV 毒株感染進行鑒別工作，還可以用來對ASFV 產生CPE和其它病毒產生CPE 進行區別。免疫熒光檢測法對于急性ASF 感染的檢測時效極高，但是對于亞急性或者是慢性感染的檢測就不那么迅速了，這與感染組織可能已經異變成抗原體復合物阻止了與檢測用抗體相結合的通道有關[3]。

2.2 ELISA 法

ELISA 檢測法是通過Wardley 等用抗ASFV的特異性血清IgG 作為包被蛋白而進行的檢測法，其對于 ASFV 抗原檢測濃度為 50-500 HAD50/ml。基于p72（病毒衣殼蛋白）單抗的雙抗夾心ELISA 法具有較強的靈敏度[3]。目前，針對這種檢測方法，已經發明了ASFV 抗原ELISA 檢測試劑盒，其設備要求低，使用起來簡單，性價比高，在市場上流通很快，但是與熒光定量PCR 檢測法相比，檢測的準確性和特異性還需要進一步的提升。

2.3 免疫層析試紙條法

免疫層析試紙條是用抗VP72 蛋白單克隆抗體研制而成的。通過對比實驗結果表明，試紙條可以檢測病毒的含量是超過104HAU 的樣本，通過臨床試驗可以看出，三種檢測方式其準確率不同，檢測率最高最準確的是PCR，其次就是檢測率達60 % 的試紙條，而抗原間接ELISA 試劑盒僅有48 % 的準確率[4]。

3 分子生物學檢測方法

除了免疫學檢測技術，還有分子生物學檢測法，其檢測反應更為精準，更加適用于高通量檢測。上文提到OIE 推薦的PCR 檢測法是普遍認可的ASFV 檢測的“金標準”。對于PCE 的探索國內外學者從未停止，目前甚至出現數字PCR、重組酶聚合酶擴增等方法[5]。

3.1 常規PCR 檢測法

常規PCR 檢測法針對ASFV 最多能檢測的DNA 數值是從幾十到上百。通過VP72 基因設計而建立起的常規PCR 檢測法是可以檢測到0.12HAU50濃度的ASFV，而且其特異性表現良好，是OIE 推薦的檢測方法。

除可以單獨檢測ASFV 的方法，更有檢測多種病原的PCR 檢測方法。如可以同時對ASFV、豬瘟病毒、高致病性藍耳病病毒和為狂犬病病毒進行檢測的多重PCR 法[6]。

3.2 熒光定量PCR 檢測法

熒光定量PCR 檢測法比常規PCR 檢測對于基因片段的擴增更短，不僅反應快速，而且最低檢出的限度可以從幾個到幾十個拷貝的DNA 模板。在操作時不用開蓋的優點降低了擴增產物被污染的可能性，因此是現今ASFV 檢測被使用頻率最高的方法。

3.3 恒溫擴增檢測法

近幾年，分子診斷技術越來越成為研究重點，恒溫擴增檢測技術應運而生。其優勢在于可以降低實驗操作成本，不用通過造價較高的熱循環設備，只需使用普通的水浴設備就可以在單一溫度中進行測試，而且反應迅速；在檢測時肉眼直觀的可以根據體系中染料色彩變化或者時試紙條上檢測線來分辨結果，是一種可以現場完成測試的檢測方法[7]。

4 小結

綜上所述，依據我國對于ASF 防控政策，對于ASFV 的分離和鑒定還沒有完全放開，只能在特定的實驗室進行，盡管試紙條和ELISA 這樣的檢測方法既便利又快捷，但是受制于檢測限，也只能用來檢測急性病例和病死豬而已。對非洲豬瘟的防控研究，還有很長的一段路要走，希望在未來的科學研究中，能夠早日打破現在的局面，讓抗疫疫苗早日面世。