HER2靶向載HSV-TK基因并具有核定位效應的納米超聲造影劑制備

張月，周厚妊，羅語岑，辛瑩，劉小奇，劉治軍

1中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110004；2沈陽藥科大學藥學院

分子靶向超聲造影是近年來發展起來的一項新技術，良好的超聲造影劑是實現分子靶向超聲造影的關鍵。在過去的幾十年里，超聲造影劑大多是載著特異性靶向抗體、藥物或基因的微泡，用于腫瘤或炎癥血管內靶向診斷和治療，并且得到了廣泛的研究。然而，微泡的粒徑限制了其對腫瘤血管內皮間隙（380～780 nm）的穿透，使其不能更好地針對腫瘤細胞。因此，為實現靶向性血管外超聲分子成像，亟需納米級超聲造影劑［1］。自殺基因療法對腫瘤細胞有高度選擇性，被認為有可能成為一把潛在的對抗腫瘤的利器［2］。單純皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋（HSV-TK/GCV）是目前自殺基因療法中最為常用且成熟有效的，胸苷激酶（TK）基因是藥敏基因，腫瘤細胞轉染該基因后，前體藥物丙氧鳥苷（GCV）或無環鳥苷（ACV）會變得敏感，從而導致腫瘤細胞死亡［3］。2019年1月—11月，本研究采用前期課題組制備的胍基化SS-PAAs類陽離子聚合物（AGMCBA）作為HSV-TK自殺基因的核定位載體［4-5］，再利用人上皮生長因子受體2（HER2）靶向納米超聲造影劑包裹作為基因的靶向載體，研究該納米超聲造影劑的理化特性和體外超聲顯影效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、生物素化二硬酯酰磷脂酰乙醇胺（Biotin-DSPE-PEG2000）購自美國Avanti公司；膽固醇（天津市光復精細化工研究所）；全氟己烷（PFH，Shangfluoro公司）；鏈霉親和素（美國Bioss公司）；HSV-TK（上海生工生物工程有限公司）；抗HER2抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）-抗HER2抗體（上海億欣生物科技有限公司）；Hochest33342、Cy5熒光染料（碧云天生物技術有限公司）；NCI-N87胃癌細胞株（中國科學院細胞庫）；PBS緩沖液（Solarbio公司）。旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；酶標儀（Thermo Fisher公司，美國）；湘儀H-1650高速離心機；脂質體擠出器（LiposoFast，Avestin公司）；低功率聚焦超聲儀（重慶融海超聲醫學工程研究中心）；激光粒度儀及電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）；SN3400掃描電子顯微鏡；激光共聚焦顯微鏡（德國）；電子天平（Sartorius公司）；恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；FACSAria流式細胞儀；KH5200DB型數控超聲波清洗器；超聲波診斷儀（PhilipsIU22）。

1.2 AGM-CBA／HSV-TK載體基因復合物的制備 AGM-CBA由前期課題組合成［4］。制備一定濃度AGM-CBA的PBS溶液，記為溶液A；另制備一定濃度HSV-TK質粒的PBS溶液，記為溶液B。隨后分別將等體積不同濃度溶液A小心加入等體積溶液B中，輕輕混勻，37℃孵箱中孵育30 min制備得到載體/基因復合物。并取上述少許復合物溶液采用馬爾文激光粒度儀檢測其粒徑。

1.3 載HSV-TK基因及PFH的納米超聲造影劑的制備以及基因在造影劑中包封率的測定 ①將制好的載體基因復合物放到4℃冰箱備用。②稱取8.8 mg DPPC、3.0 mg膽固醇、2.8 mg Biotin-DSPEPEG2000（DPPC∶膽固醇∶Biotin-DSPE-PEG2000的摩爾比為60∶40∶5），加無水乙醇2 mL，37℃水浴，攪拌使其溶解（溶解過程中用錫箔紙封住瓶口，防止蒸發）。將其置于旋轉蒸發儀，以37℃旋蒸30 min，使磷脂/膽固醇的乙醇液在壁上成膜，減壓除乙醇，氮氣吹干30 min，制備脂質膜。另取PBS緩沖液2 mL，置于小燒杯內，37℃水浴中保溫，待用。將制備好的載體基因復合物加入上述PBS緩沖液中，再將包含載體基因復合物的PBS緩沖液加入制備好的脂質膜中，轉動下37℃水化30 min，即制得包載載體基因復合物的脂質體。③取上一步驟中的脂質體混懸液0.75 mL轉移至2 mL EP管內，向EP管內逐滴加入40μL PFH。在全程冰浴條件下，采用超聲波清洗器對EP管內混合液進行震蕩，頻率為80 Hz，時間設為16 min。④將混合液裝入離心管，轉速12 000 r/min，離心2 min，去上清于聚乙烯管備用，然后向離心管加入PBS緩沖液，用漩渦振蕩器混勻，重復3次，以去除未結合的脂質及PFH，最后得到乳白色的脂質包裹載體基因復合物及PFH的造影劑。⑤將做成的脂質體依次通過夾有1μm及400 nm的聚碳酸酯膜的擠出器，分別擠出21次，最終制得載有HSV-TK基因及PFH的納米超聲造影劑。⑥將造影劑置于4℃冰箱內保存備用。⑦上清液中含有未包裹于造影劑的載體/基因復合物，向裝有上清液的聚乙烯管中加入等體積的肝素鈉，37℃孵育30 min，即將復合物中的HSV-TK替換為肝素。采用酶標儀測量復合物的熒光強度，設置激發波長為510 nm、發射波長為595 nm。通過HSV-TK溶液的標準曲線計算游離基因的含量。造影劑對基因的包封率的計算公式［6］為包封率（%）=（投入量-游離量）/游離量×100%。

1.4 HER2靶向納米超聲造影劑的制備 取上述納米超聲造影劑100μL加入900μL的PBS溶液中稀釋；然后加入鏈霉親和素30μL（5 mg/mL），間斷輕微搖晃并將其置于4℃下靜置30 min后離心（12 000 r/min，2 min），去除上清液，PBS緩沖液洗滌3次，加入生物素化HER2抗體25μL（1μg/mL），輕輕搖勻后繼續放置于4℃冰箱中避光反應30 min；反應后取出混合液離心（12 000 r/min，2 min），去除上清，PBS緩沖液洗滌3遍，即制得HER2靶向納米超聲造影劑。

1.5 靶向納米超聲造影劑的基本特性鑒定及形態學觀察 取上述少許造影劑溶液置于掃描電子顯微鏡，觀察其形態及均一性；另取少許造影劑溶液，采用馬爾文激光粒度儀檢測造影劑粒徑及電位。

1.6 HER2抗體與造影劑的連接情況檢測 取9μL的異硫氰酸熒光素—抗HER2抗體分別緩慢滴加于按上述方法制備好的非靶向超聲造影劑和HER2靶向超聲造影劑中，采用流式細胞儀分別對造影劑與HER2抗體連接前后進行定量檢測。

1.7 靶向納米超聲造影劑的核定位效應實驗 HSVTK先用Cy5熒光染料標記（Label IT?核酸標記技術），再制備HER2靶向納米超聲造影劑。將課題組之前培養的NCI-N87胃癌細胞以2×105細胞/皿的密度接種在培養皿的蓋玻片上培養過夜。轉染研究前，將培養基更換為新鮮的無血清培養基。然后將100μL載有AGM-CBA／HSV-TK的靶向納米超聲造影劑的復合物添加到每個孔中，隨之用低頻超聲輻照。低頻超聲照射條件根據前期課題組優化后設置為650 kHz，1.5 W/cm2，照射時間60 s。將NCIN87細胞在37℃下培養4 h，并用PBS洗滌細胞3次。將8μg/mL的Hoechst 33342孵育以染色細胞核，然后用4%多聚甲醛（1.5 mL/皿）固定30 min，最后使用激光共聚焦顯微鏡來分析該造影劑的核定位作用。

1.8 體外顯影實驗 以制備的靶向納米超聲造影劑為實驗組，以超純水為對照組，以巴氏滴管作為體外模型。將實驗組和對照組樣品吸入滴管中，使用PhilipsIU22彩色超聲診斷儀，采用造影模式（L9-3/Cont Gen），熱指數（TIS）為0，機械指數（MI）為0.13進行超聲造影成像。

2 結果

2.1 AGM-CBA/HSV-TK載體基因復合物的粒徑 馬爾文激光粒度儀顯示，AGM-CBA/HSV-TK載體基因復合物的粒徑為（96.73±1.27）nm。

2.2 HSV-TK基因在超聲造影劑中的包封率 HSV-TK基因在超聲造影劑中的包封率約為63%。

2.3 靶向納米超聲造影劑的形態特征 在宏觀狀態下，超聲造影劑溶液呈乳白色，不透明，靜置一段時間后沒有明顯的分層現象；掃描電子顯微鏡下觀察發現，造影劑呈球形，表面較光滑，大小均一，形態規則；馬爾文激光粒度儀顯示粒徑為（550.93±10.19）nm，Zeta電位為（-9.75±0.74）mV。

2.4 HER2抗體與造影劑的連接情況 非靶向超聲造影劑熒光抗體結合率為0.04%，靶向超聲造影劑熒光抗體結合率為50.24%，抗體與脂質體成功連接。

2.5 靶向納米超聲造影劑的核定位效應 經過4 h的轉染，大部分細胞均能觀察到紅色熒光，表明HSV-TK成功遞送至細胞中。

2.6 體外顯影效果 超聲造影成像結果顯示，靶向納米超聲造影劑回聲明顯增強，并表現為細膩均勻的點狀密集高回聲；超純水則為無回聲。

3 討論

分子影像學的出現是醫學影像學發展的一個里程碑，超聲造影劑作為分子成像的一個重要組成部分，在臨床試驗中得到了廣泛的應用，擴展了傳統成像模式的診斷能力和實用價值。與微米尺寸的超聲造影劑相比，納米級別的造影劑更適合于靶向分子成像，且其尺寸更小，更可能作為治療手段，已成為近年來的研究熱點［7-8］。納米級超聲造影劑中，脂質體外殼包裹氟碳化合物形成的納米泡成像效果最好。DPPC及DSPE是兩種合成磷脂，是許多細胞膜的主要磷脂成分，具有良好的生物相容性，膽固醇具有調節膜流動性的作用。故本研究采用薄膜水化機械振蕩法，以合成磷脂（DPPC、DSPE）、膽固醇為成膜材料制備脂質體超聲造影劑。掃描電鏡下見造影劑納泡呈球形，形態規則，動態光散射測定粒徑為（550.93±10.19）nm，其能穿透腫瘤血管內皮間隙，使在血管外超聲分子成像成為可能。

本研究以前期課題組構建的聚合物AGM-CBA作為HSV-TK的核定位載體，該聚合物具備將不同質粒DNA壓縮為納米級基因/載體復合物的能力，能夠對質粒DNA實現穩定包載，保護其不被核酸酶降解；形成的載體基因復合物主要通過網格蛋白和小窩蛋白介導的途徑入胞，同時入胞后被包載的質粒DNA有很好的釋放效率。既往研究結果表明，其細胞毒性更低，轉染效率更高，表現出優良的核定位效應［9-10］，具有良好的應用前景。

超聲造影劑接靶方法有多種，如共價偶聯法、吸附法等。其中，“生物素—親和素橋接法”是目前應用最為廣泛的接靶方法。該方法不僅操作簡便、接靶效率高，而且連接牢固。生物素與親和素之間以非共價鍵結合，所以也是目前已知最強的一種結合粘連系統［11-12］。鏈霉親和素是一種類似于親和素的蛋白質，它有四個亞基能夠與生物素連接，每個亞基可以結合一個生物素分子，因而其親和力高于親和素，且價格低廉。本研究應用該方法，以在許多腫瘤中都有過表達抗原HER2為靶點，利用鏈霉親和素將生物素化HER2抗體和Biotin-DSPE-PEG2000非共價鍵結合，成功制備出HER2靶向超聲造影劑，流式細胞儀檢測其連接率較理想。但與傳統超聲造影劑相比，靶向納米超聲造影劑是否有更好的穩定性仍需進一步研究。

自殺基因療法是一種非常具有前景的腫瘤治療方法，自殺基因進入腫瘤細胞，并在合適的底物存在下誘導腫瘤細胞凋亡。除了誘導細胞凋亡外，參與這一過程的另一種機制是旁觀者效應，即轉染細胞產生的有毒代謝物被轉移到鄰近細胞，導致細胞死亡。HSV-TK/GCV系統是目前最常用的自殺基因治療系統之一，HSV-TK自殺基因的表達可導致胸苷激酶的產生，這種酶可將GCV單磷酸化，細胞激酶將無毒的單磷酸化GCV轉化為有毒的GCV三磷酸，即脫氧鳥苷三磷酸類似物，它可以抑制DNA聚合酶并破壞DNA合成［13-15］。故本研究通過構建一種攜帶HSV-TK自殺基因的脂質超聲造影劑，以期成為傳遞抗腫瘤基因的有效載體，自殺基因的殺傷腫瘤細胞的效果將在后續的細胞實驗中進一步考察。

液態氟碳類造影劑在體內顯像方面存在更多優勢，如更低的毒理學危險度、更長的組織內循環時間及可更加持久的抵抗外界壓力和機械應力的變化［16］。PFH作為一種安全無毒的液體，具有相轉變特性。有研究表明將PFH包裹在納米粒中，利用其相轉變特性瞬間釋放能量，可殺傷腫瘤［17-18］。并且，氣化后的PFH可形成微米級氣泡，仍具備增強回聲信號的能力。故本研究采用PFH作為脂質體超聲造影劑的顯像內核，并且體外顯影效果理想。

綜上所述，本研究制備了一種以HER2為靶點同時載有HSV-TK基因且具有核定位效應的納米超聲造影劑，其大小分布均勻，形態規則，且有良好的體外超聲顯影效果。本實驗為后續的體外細胞實驗和體內動物實驗奠定了一定基礎。