骨髓瘤診斷及預(yù)后評(píng)估的新標(biāo)志物-胞外囊泡

劉曉莉 周林 韓崇旭

1大連醫(yī)科大學(xué)研究生院（遼寧大連116044）；2揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科（江蘇揚(yáng)州225001）

骨髓瘤，又稱多發(fā)性骨髓瘤（multiple myelo?ma，MM），是以骨髓中克隆性漿細(xì)胞增殖紊亂為特點(diǎn)的惡性血液系統(tǒng)疾病，在血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率排名第二［1-2］。隨著國內(nèi)人口的老齡化，該病的發(fā)生率也逐年上升。目前，MM是通過骨髓中克隆性漿細(xì)胞的數(shù)量、M蛋白的濃度水平以及相應(yīng)的臨床癥狀（高鈣血癥、腎損傷、骨質(zhì)破壞和貧血）進(jìn)行診斷，患者一旦被確診為MM，均已出現(xiàn)不同程度的器官損傷，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后［3］；此外，難治、易復(fù)發(fā)使MM至今仍成為不可治愈的血液系統(tǒng)疾病［4］。因此MM的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測對(duì)MM患者的生存就顯得尤為重要。胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細(xì)胞分泌的一種膜性囊泡［5］，其內(nèi)容物中含有豐富的蛋白質(zhì)、非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）、脂質(zhì)、細(xì)胞因子、酶等具有生物學(xué)活性的分子，這些分子的存在可在一定程度上反映其所來源的細(xì)胞特性［6］。當(dāng)骨髓微環(huán)境中的EVs與克隆性漿細(xì)胞相互作用時(shí)，克隆性漿細(xì)胞通過對(duì)EVs的識(shí)別、內(nèi)化等過程誘導(dǎo)自身的增殖分化［7］，表明EVs在MM的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。

1 胞外囊泡的生物學(xué)特性

EVs現(xiàn)有的分類主要依賴于囊泡體積大小和生物學(xué)發(fā)生機(jī)制［8］。最新的研究表明，EVs的兩個(gè)主要類別是囊泡體和外泌體，囊泡體主要包括微粒和微囊泡，其發(fā)生機(jī)制目前認(rèn)為是細(xì)胞通過質(zhì)膜直接出芽釋放而來，大小范圍為50 nm至1mm；而外泌體的發(fā)生機(jī)制則更為復(fù)雜，其是細(xì)胞通過胞吞作用后，在胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)過早期分選內(nèi)體、晚期分選內(nèi)體最終形成包含有多個(gè)管腔內(nèi)囊泡（intralu?minal vesicle，ILVs）的多泡體，當(dāng)多泡體與質(zhì)膜發(fā)生融合后，通過胞吐作用將ILVs釋放到細(xì)胞外，釋放到細(xì)胞外的ILVs被稱為外泌體，直徑約為30～160 nm［9］。

由于EVs在細(xì)胞外環(huán)境中的廣泛存在，且依靠其獨(dú)特的脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)、納米級(jí)的體積以及內(nèi)容物中含有的豐富的生物活性物質(zhì)，因此，EVs具有發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞間生物學(xué)作用的獨(dú)特優(yōu)勢。現(xiàn)有的研究表明，EVs可分別通過下述三種不同的途徑來調(diào)控受體細(xì)胞：（1）可通過吞噬和胞飲作用被受體細(xì)胞特異性攝取；（2）可通過受體?配體作用被受體細(xì)胞捕獲；（3）可通過與受體細(xì)胞質(zhì)膜之間的直接融合；當(dāng)EVs被靶細(xì)胞內(nèi)化后，EVs中的內(nèi)容物會(huì)通過溶酶體逃逸的間接途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核或胞膜，從而發(fā)揮調(diào)控受體細(xì)胞的生物學(xué)功能的作用［10-11］。EVs的這一特性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［12］。

2 胞外囊泡對(duì)多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展的影響

最新的研究表明，骨髓瘤細(xì)胞衍生的EVs能被骨髓瘤微環(huán)境中的特定細(xì)胞攝取［如NK細(xì)胞、髓源抑制性細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow?derived mesenchymal stem cells，BMSCs）、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等］，并改變上述細(xì)胞的生物學(xué)特性，形成有利于骨髓瘤細(xì)胞增殖、分化的骨髓微環(huán)境，從而對(duì)MM患者產(chǎn)生局部或全身性的影響，與此同時(shí)，骨髓中各類基質(zhì)細(xì)胞衍生的EVs被骨髓瘤細(xì)胞攝取后，能夠促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、加劇骨質(zhì)破壞、藥物耐受等［13］，最終導(dǎo)致骨髓瘤患者的進(jìn)展。

2.1 胞外囊泡促進(jìn)骨髓瘤患者的免疫抑制MM患者骨髓中各類細(xì)胞來源的EVs對(duì)機(jī)體發(fā)揮著負(fù)向免疫調(diào)節(jié)的作用，促進(jìn)了疾病的進(jìn)展。文獻(xiàn)報(bào)道，MM患者的BMSCs來源的EVs可誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中CD3+和CD4+淋巴細(xì)胞凋亡，促進(jìn)具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化、增殖，引起具有免疫抑制作用的炎性因子IL?10的濃度升高，從而加劇了MM患者的免疫抑制，促進(jìn)了骨髓瘤細(xì)胞的免疫逃逸［14］；同樣，WANG等［15］在荷瘤小鼠模型中的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs來源的EVs，通過活化MDSCs的STAT3、STAT1等信號(hào)通路，促進(jìn)了MD?SCs的增殖和活化，并通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl?xL和Mcl?1的表達(dá)，抑制MDSCs的凋亡，促進(jìn)了MD?SCs細(xì)胞的免疫抑制功能，從而加速M(fèi)M的進(jìn)展。

2.2 胞外囊泡促進(jìn)骨髓瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)破壞及治療耐受在缺氧環(huán)境下，骨髓瘤細(xì)胞釋放的高表達(dá)miR?135b的EVs，被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化后，可下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子抑制因子（factor?inhibiting hypoxia inducible factor1，F(xiàn)IH?1），并通過HIF?FIH信號(hào)通路增加內(nèi)皮血管的形成，促進(jìn)了MM的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［16］；此外，EVs還可以加劇上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)MM的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散［17］。骨髓瘤細(xì)胞來源的外泌體中含有具有生物活性的lncRNARUNX2?AS1，并可以傳遞給間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stromal cells，MSCs），在MSCs中l(wèi)ncRNARUNX2?AS1與pre?RUNX2形成RNA雙鏈，阻止mRNA的剪切，并以一種負(fù)反饋的方式調(diào)節(jié)RUNX2 mRNA和蛋白表達(dá)，降低MSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而抑制骨的生成［18］；FAICT等［19］從5TGM1小鼠骨髓瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細(xì)胞來源的EVs可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性與功能，抑制成骨細(xì)胞分化。此外，EVs還參與了MM耐藥性的產(chǎn)生。ZHANG等［20］研究表明，MM患者硼替佐米的耐藥性的產(chǎn)生可能與外泌體中的miR?16?5p、miR?15a?5p和miR?20a?5p、miR?17?5p的下調(diào)有關(guān)。總之，EVs通過促血管生成、抑制骨合成、調(diào)控治療耐受等途徑，促進(jìn)了MM的發(fā)生、發(fā)展。

3 胞外囊泡作為新型液體活檢標(biāo)志物在骨髓瘤早期診斷和預(yù)后評(píng)估中的研究進(jìn)展

細(xì)胞主要通過運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）依賴或ESCRT非依賴途徑調(diào)控不同類型EVs的釋放以及其內(nèi)容物分子的分選和裝配，從而導(dǎo)致EVs既具有與來源細(xì)胞的同源性，同時(shí)也具備有別于來源細(xì)胞的獨(dú)特性，因此，EVs作為疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的新型液體活檢標(biāo)志物備受關(guān)注［21］。在實(shí)體腫瘤領(lǐng)域，已有相關(guān)的研究表明特異性EVs群在胰腺癌、肺癌等疾病的診斷和預(yù)后評(píng)估中有重要的價(jià)值［22-23］。而在血液系統(tǒng)腫瘤的研究中，EVs在B細(xì)胞惡性腫瘤中已經(jīng)取得一定的研究進(jìn)展［24］。骨髓瘤患者的臨床表現(xiàn)較為多樣化［25］，在臨床診療中很容易出現(xiàn)誤診和漏診，且現(xiàn)有的有創(chuàng)診斷方式會(huì)給患者帶來巨大的痛苦，因此更加需要發(fā)現(xiàn)具有特異性的、能夠反映骨髓中克隆性漿細(xì)胞增殖情況的新型標(biāo)志物來解決上述問題。

3.1 胞外囊泡作為骨髓瘤患者早期診斷的新型液體活檢標(biāo)志物研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，MM患者外周血中的總的EVs，尤其是CD138+EVs的數(shù)量顯著升高，提示CD138+EVs可作為MM診斷的一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，且該群EVs數(shù)量較血清M蛋白能夠更為敏感地反映患者的治療效果及復(fù)發(fā)監(jiān)測［26］。也有研究發(fā)現(xiàn)，MM細(xì)胞釋放的外泌體可表達(dá)腫瘤B細(xì)胞的免疫球蛋白B細(xì)胞受體（Ig?BCR），其可以被獨(dú)特型結(jié)合肽（Id?peptide）靶向結(jié)合，研究者使用5T33MM細(xì)胞表達(dá)的Ig?BCR作為誘餌，通過篩選噬菌體展示文庫來選擇Id肽，篩選出p5肽作為特異性肽結(jié)合物，結(jié)果證明利用獨(dú)特型結(jié)合肽檢測血清中MM細(xì)胞來源的外泌體比傳統(tǒng)的M蛋白檢測能更早的發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞的存在，提示p5肽陽性的外泌體可作為MM患者的早期診斷新型生物標(biāo)志物［27］。除了上述具有獨(dú)特表型的EVs在MM的早期診斷中具有重要作用以外，EVs內(nèi)容物中的非編碼RNA（ncRNA）及某些具有特定功能的蛋白質(zhì)也對(duì)MM早期診斷具有提示作用。在ncRNA領(lǐng)域，目前研究最多的為MicroRNA、lncRNA等，研究顯示，外泌體中的miR?21、miR?164a的表達(dá)水平在MM的診斷中也有重要的作用［28］。SEDLARIKOVA等［29］研究發(fā)現(xiàn)，外周血外泌體中的lncRNAPRIN對(duì)MM及意義未名的單克隆丙種球蛋白血癥（monoclonal gammopathy of un?determined significance，MGUS）的診斷敏感性和特異性分別為84.9%、83.3%，其中PRINS對(duì)MGUS具有更高的診斷效能，提示血清外泌體中的lncRNA PRINS可成為MGUS輔助診斷的新的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。此外，在對(duì)EVs內(nèi)容物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)MM患者外泌體中含有高表達(dá)的酪氨酸蛋白激酶（c?src），而在正常人及MGUS患者的外泌體中卻未見該蛋白的表達(dá)，提示外泌體中的c?src不僅可用于MM診斷，更可作為MGUS與MM患者鑒別診斷的高特異性的新型標(biāo)志物［30］。EVs作為新型的液體活體標(biāo)志物與傳統(tǒng)的MM診斷手段相比，能夠更早期、更特異的輔助診斷MM，且通過外周血樣本的檢測就能實(shí)現(xiàn)，減少患者行骨髓穿刺手術(shù)的痛苦。

3.2 胞外囊泡作為骨髓瘤患者預(yù)后評(píng)估的新型液體活檢標(biāo)志物一般情況下，影響骨髓瘤患者預(yù)后的因素，主要包括宿主因素、腫瘤特征和治療方式［31］，目前，對(duì)于EVs的研究更多的集中在腫瘤特征這一方面。MANIER等［32］分析了156例新診斷的MM患者，發(fā)現(xiàn)MM患者外周血外泌體中的22個(gè)miRNA水平顯著低于健康者，其中l(wèi)et?7b、let?7e、miR?106a、miR?106b、miR?155、miR?16、miR?17、miR?18a和miR?20a被確定為無進(jìn)展生存的重要預(yù)測指標(biāo)，而let?7b和miR?18a是總生存率重要的預(yù)測因子，且let?7b或miR?18a的低表達(dá)與ISS高的分期顯著相關(guān)。ZHANG等［33］研究也證明，在ISS分期中，Ⅰ期患者let?7d?5p和miR?425a?5p的表達(dá)水平明顯高于Ⅱ期和Ⅲ期患者；與腎臟未損傷的患者相比較，發(fā)生腎損傷患者的let?7c?5p，let?7d?5p 5p，miR?140?3p，miR?185?5p和miR?425?5p降低；具有高水平的IL?6患者顯示出let?7c?5p，miR?140?3p，miR?185?5p和miR?425?5p的低表達(dá)，這些結(jié)果表明，外泌體miRNA表達(dá)的下降可能與骨髓瘤臨床癥狀的發(fā)展和疾病的進(jìn)展有關(guān)。lnc00461在MM細(xì)胞及MSCs中高表達(dá)，MSCs通過外泌體向MM細(xì)胞傳遞lnc00461，抑制MM細(xì)胞中的miR?15a和miR?16的表達(dá)，從而上調(diào)了MM細(xì)胞的BCL?2的表達(dá)，促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡；研究結(jié)果還證實(shí)MSCs來源的外泌體中的lnc00461與MM患者的生存率及預(yù)后密切相關(guān)，與lnc00461低表達(dá)組相比，高表達(dá)組患者有較差的生存結(jié)果的表現(xiàn)［34］。XU等［35］研究也發(fā)現(xiàn)，lncPSMA3?AS1和PSMA3在硼替佐米耐藥的MSCs來源的外泌體中表達(dá)增加，通過檢測外泌體中l(wèi)ncPSMA3?AS1和PSMA3可評(píng)估應(yīng)用硼替佐米治療后對(duì)疾病的改善情況，提示循環(huán)外泌體中的lncPSMA3?AS1和PS?MA3有望成為除國際分期系統(tǒng)外的一種新型預(yù)后分層指標(biāo)。還有研究發(fā)現(xiàn)piRNA823主要在MM患者外周血的EVs及MM細(xì)胞衍生的EVs中富積，發(fā)現(xiàn)piRNA?823在ISS分期中II期和III期患者的外周血中顯著增加；血清EVs中piRNA?823的增加與傳統(tǒng)標(biāo)志物β2?MG（r=0.800，P<0.01）呈正相關(guān)，提示EVs中的piRNA823可作為一個(gè)新型的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)［36］。

在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域，通過蛋白質(zhì)組學(xué)評(píng)估發(fā)現(xiàn)EVs中的各類蛋白與MM患者預(yù)后的相關(guān)性。HARSHMAN等［37］研究發(fā)現(xiàn)，CD44在皮質(zhì)類固醇抵抗性MM.1R細(xì)胞系的EVs組分中特別富集，同時(shí)其在MM患者血清來源的EVs中高表達(dá)，且CD44的高表達(dá)與MM患者的總體生存率呈負(fù)相關(guān)，提示CD44也是一種MM患者的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。近年來的相關(guān)研究表明，EVs不僅可作為MM早期診斷標(biāo)志物，在患者的分期、生存預(yù)測中也具有重要意義。基于EVs獨(dú)特的生物學(xué)特性，使用EVs作為診斷后預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物具有明顯優(yōu)勢，其可通過外周血直接被檢測，可重復(fù)性高，給患者帶來的痛苦較小，且與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法相比，能夠更為特異性的反映骨髓中克隆性漿細(xì)胞的增殖情況。

4 總結(jié)與展望

截止目前，有關(guān)EVs在MM中的研究，仍較多的集中在以細(xì)胞、動(dòng)物模型為平臺(tái)的基礎(chǔ)機(jī)制研究方面，而應(yīng)用EVs作為MM患者診斷及預(yù)后監(jiān)測的新型液體活檢標(biāo)志物的臨床研究則較為少見。究其原因，主要是由于EVs的分離方法眾多且難以做到標(biāo)準(zhǔn)化，不同分析方法分析結(jié)果的一致性、再現(xiàn)性較差。有文獻(xiàn)報(bào)道，研究者們使用不同的分離方法會(huì)導(dǎo)致EVs及其RNA的濃度、純度或大小存在差異［38］。除此之外，在使用EVs相關(guān)的內(nèi)容物（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）作為標(biāo)志物研究時(shí)，應(yīng)盡可能的選擇純度較高的提取EVs的方法，且由于患者血清或血漿中存在多種的可溶性蛋白或游離DNA或RNA，這些蛋白或DNA、RNA可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生正向或負(fù)向的影響，因此在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)盡可能證明被研究的標(biāo)志物是來自EVs，以免造成研究者得出錯(cuò)誤的結(jié)論［39］。上述原因也成為了研究者們開展針對(duì)特異性EVs或EVs中的特異性表達(dá)的內(nèi)容物的臨床研究難以逾越的障礙。

此外，EVs至今未應(yīng)用于MM的臨床診斷和預(yù)后評(píng)估，其中最為重要的原因在于，研究者們還沒有能夠通過實(shí)驗(yàn)研究，在外周血中找到與骨髓中克隆性漿細(xì)胞呈高特異性相關(guān)的胞外囊泡群，不過隨著EVs分離純化方法標(biāo)準(zhǔn)化、各種更為先進(jìn)的檢測技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，特異性EVs終將會(huì)成為一個(gè)MM診斷和預(yù)后評(píng)估的新型液體活檢標(biāo)志物。