大黃酸對CCl4中毒肝纖維化大鼠肝臟中α-SMA、MMP-13及TIMP-1的影響①

郭 冶，盧鳳美，黃 蓉，位小杰，張曉波，劉東璞(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

肝臟疾病(肝炎、肝硬化、肝癌等)是導致人們健康負擔的重要原因，據報道：全球肝硬化患者死亡人數1980年約67.6萬[1]，2013年約122.1萬[2]，而肝纖維化(hepatic fibrosis)是其發生、發展的中間環節。肝纖維化是指各種病因，如感染、病毒、寄生蟲、藥物、酒精、遺傳、化學毒物等，引起肝細胞發生炎癥及壞死等變化，刺激并激活靜止的肝星狀細胞(quiescent HSCs, qHSCs)，活化的肝星狀細胞(activated HSCs, aHSCs)轉化成可以釋放大量α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的肌成纖維細胞(myofibroblast, MFB)，進而肝臟中細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的合成與降解平衡失調，導致肝內纖維膠原組織異常沉積的病理過程。隨著“補充和替代醫療(Complementary and Alternative Medicine，CAM)”的發展，新型生物活性物質，如特性中藥成份及早干預肝纖維化是有效的[3]。通過本實驗研究大黃酸有抑制肝纖維化發展的作用[4，5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康成年SPF級SD雄性大鼠(180～220g)60只。由佳木斯大學實驗動物中心提供，使用許可證號：[SYXK(黑)2016-014)。本研究根據美國第8版《實驗動物飼養管理和使用指南》中國際公認的實驗室動物使用和護理原則，健康和營養狀況在同一水平的大鼠進行觀察喂養，進行實驗。

1.1.2 實驗試劑

大黃酸購于淮安市巍偉植化研究所，秋水仙堿(國藥準字H20113208)廣東彼迪藥業有限公司生產，α-SMA多克隆抗體購于Boster公司，MMP-13及TIMP-1單克隆抗體購于Abcam公司，RT-PCR試劑盒均購于Foregene公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將60只大鼠飼養于恒溫(22±2)℃條件下，標準柱粒狀飼料飼養，自由飲水，觀察3d后隨機分為5組，分別為：空白對照組(N組)，CCl4模型對照組(M組)、秋水仙堿干預組(C組)、大黃酸低劑量干預組(RL組)、大黃酸高劑量干預組(RH組)。每組各12只。

1.2.2 動物模型建立

肝纖維化模型制備：M、C、RL、RH組大鼠腹腔注射40%CCl4與花生油混合物，3mL/kg，2次/周。N組腹腔注射等體積的花生油，共7周。

1.2.3 動物給藥方法

造模后3周，C、RL、RH組大鼠分別給予秋水仙堿0.2mg/kg、大黃酸50mg/kg、大黃酸100mg/kg溶于生理鹽水的混懸液灌胃治療，3次/周，共4周。N組、M組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.2.4 肝組織病理學、IHC及RT-PCR觀察

各組大鼠肝臟組織取制作好的石蠟切片，進行蘇木素&伊紅(H&E)染色，采用SABC法進行IHC實驗，光學顯微鏡下觀察α- SMA、MMP-13及TIMP-1蛋白陽性結果表達情況。按照RT-PCR試劑盒從肝臟組織中提取總RNA，再以1.0ug總RNA作為模板， 去gDNA 42℃ 2min， 失活 gDNase42℃ 15min，失活逆轉錄酶85℃ 5sec，合成cDNA。進行熒光定量實時PCR擴增反應，95℃ 10min，95℃ 15sec，60℃ 1min進行40個循環，從而得出同時測出的需檢測基因與內參基因擴增產物Ct值，進而檢測2-ΔΔCt值進行靶基因細胞因子的定量分析。以上述觀察肝纖維化活躍程度。引物由通用生物合成，見表1。

表1 實時PCR反應的引物設計

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠肝臟組織病理學觀察

大鼠肝臟組織切片進行H&E染色后，經病理科醫師判定診斷：N組肝小葉結構排列整齊，肝細胞形態正常；與N組比較，M組肝小葉結構紊亂，肝小葉間大量纖維膠原組織增生，較寬，延伸入小葉間，有少量形成完整假小葉間隔，肝條索間隙增寬，伴肝細胞脂肪變及氣球樣變；與M組比較，C、RL、RH組纖維膠原組織明顯減少，其中RH組纖維化程度最輕。見圖1。

圖1 實驗第7周末各組大鼠肝臟組織病理學結構(H&E，×200)

2.2 大鼠肝臟組織IHC中a-SMA和MMP-13蛋白的表達

大鼠肝臟組織IHC切片觀察，纖維膠原組織呈棕黃色為陽性表達。見圖2、3。在α-SMA蛋白表達中，N組陰性表達，中央靜脈邊緣少量棕黃色著色；與N組比較，M組肝纖維膠原組織及中央靜脈區全部表達陽性；與M組比較，C、RL、RH組陽性表達明顯減少，其中RH組陽性表達程度最輕，說明肝纖維化程度越輕。在MMP-13蛋白表達中，N組陰性表達；與N組比較，M、C、RL、RH組陽性表達相對增加，其中RH組陽性表達程度最高，說明肝纖維化程度最輕。見表2。

表2 5組大鼠肝臟組織IHC中α-SMA、MMP-13因子AOD值的表達

圖2 實驗第7周末各組大鼠肝臟組織a-SMA蛋白的表達(IHC，×400)

圖3 實驗第7周末各組大鼠肝臟組織MMP-13蛋白的表達(IHC，×400)

2.3 大鼠肝臟組織RT-PCR中a-SMA、MMP-13及TIMP-1 mRNA的表達

大鼠肝臟組織RT-PCR中a-SMA及TIMP-1 mRNA的表達，N組含量少，條帶亮度輕；與N組比較，RH、C、RL、M組表達量逐漸升高，M組含量最高，條帶亮度最重；MMP-13 mRNA的表達，M組表達最少，與M組比較，N、C、RL、RH組表達量及亮度逐漸升高，其中RH含量最高。見圖4。

圖4 實驗第7周末各組肝臟組織瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

肝纖維化早期階段，膠原沉積在Disse間隙內皮下，使間隙變小甚至完全消失，進而肝竇毛細血管化，肝細胞間的物質運輸受阻，終因缺血缺氧、變性壞死，導致功能障礙；晚期階段(即肝硬化)，形成假小葉及結節，甚至發展到肝癌等嚴重肝病時，肝移植仍是唯一的根治途徑[6]。截止到目前，即使臨床上廣泛應用非侵入性檢測方法，但活檢仍然是診斷肝纖維化分期的金標準[7]。α-SMA是HSC活化的標志物，血小板衍生生長因子-D(PDGF-D)未能增強α-SMA的產生，能上調TIMP-1表達的能力[8]。干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和表皮生長因子(EGF)能通過刺激Smad7蛋白表達來抑制TGF-β/Smad誘導的包括肝纖維化的反應[9]。活化的肝星狀細胞分泌金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)，抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)的活性，并抑制它們降解ECM中的纖維化物質[10]。

大黃酸作為一種天然自噬調節因子，可通過調節AMPK / mTOR信號途徑有效抑制腎小管細胞的自噬活性[11]，通過TGF-β/ Smad和Wnt /β-catenin信號通路，顯著降低了腎細胞中TGF-β引起的Klotho啟動子轉錄，從而起到抗腎纖維化作用[12]。屈艷等人通過大黃酸抑制miR-21及干預TGF-β1/ Smad7通路的研究，證實大黃酸抗肺纖維化作用[13]。郭美姿等人通過CCl4造模大鼠肝纖維化進一步檢測TGF-β1和α-SMA的表達，給予大黃酸高低劑量，從大黃酸抗炎、抗氧化及抑制肝星狀細胞的活化，抑制TGF-β1作用等可能相關角度考慮，從而驗證大黃酸抗肝纖維化作用[14]。

本實驗通過細胞因子mRNA及蛋白的表達情況驗證了大黃酸有延緩肝纖維化進展的作用，大黃酸低劑量組與臨床常用西藥秋水仙堿組比較差異不顯著，無統計學意義(P>0.05)，大黃酸高劑量組療效明顯優于秋水仙堿組(P<0.05)差異顯著。由于本次實驗方法與條件有限，只做了IHC及RT-PCR，還不能揭示大黃酸抗肝纖維化的分子機制，將來還可以通過細胞因子作用的通路和基因敲除等進一步探究肝纖維化的作用機制，我們渴望在未完全進入臨床前做大量動物及細胞實驗，進而做出正確的判定，為今后在臨床中的應用打好提前戰。