I期非小細胞肺癌SLC及其受體CCR7的表達與淋巴結微轉移關系①

裴艷志，聶美楠，姜騰蛟，王曉強，李春磊，路 通，朱曉峰，鄒志田(佳木斯大學附屬第一醫院心胸外科，黑龍江 佳木斯 154003)

腫瘤表面自分泌趨化因子受體7(CCR7)高表達與腫瘤自身分泌的配體次級淋巴組織趨化因子(SLC)或T細胞分泌的配體結合后可趨化腫瘤向淋巴結方向轉移[1]。CCR7異常表達見于宮頸癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、食管鱗癌等多種腫瘤細胞，并且與腫瘤的淋巴結轉移密切相關[2]。研究[3]顯示SLC、CCR7在促進腫瘤淋巴結特異性轉移方面可能發揮著重要作用，SLC、CCR7可能參與促進非小細胞肺癌淋巴結轉移過程。本研究擬證明SLC及其受體CCR7與I期非小細胞肺癌淋巴結微轉移及TNM分期具有相關性，并可能參與非小細胞肺癌淋巴管的生成及淋巴結轉移的調控。為預測I期非小細胞肺癌淋巴結微轉移提供臨床指標，為非小細胞肺癌的靶向治療提供靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院胸外科2010-01-01～2015-01-01共60例行肺癌根治的I期NSCLC患者標本，作為病例組。納入標準：(1)經過影像學及病理學檢查而確診[4]；(2)均進行肺癌根治的I期NSCLC患者；(3)腫瘤直徑<3cm；(4)包括肺癌組織、肺門(N1)淋巴結、隆突下(N2)淋巴結；腺癌，鱗癌。排除標準：(1)伴有呼吸道及肺部感染，以及胸腔積液的患者；(2)心血管疾病及其他病史的患者；(3)神志不清的患者。同時收集10例肺良性病變患者正常肺組織(對照組1)及20例肺良性病變患者淋巴結組織(對照組2)作為對照組。所有患者知情并愿意參加本研究，經本院倫理委員會同意并簽訂知情同意書。3組患者的一般資料無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組對象的一般資料比較

1.2 方法

1.2.1應用免疫組織化學SP法檢測各組織中SLC及CCR7的表達

嚴格按照SLC及CCR7試劑盒(江蘇雨桐生物科技有限公司提供)的說明書進行操作，具體步驟如下[5]：采集肺癌組織、肺良性病變患者的正常肺組織及淋巴結組織并進行常規的石蠟包埋，制作石蠟切片后并放于67℃烘箱中進行烘片2h，直到脫蠟至無水，并用pH7.4的PBS沖洗3次，然后進行切片的煮沸清洗。每張切片加入1滴的3%的雙氧水，在室溫的環境下進行孵育10min，并以阻斷內源性過氧化物酶的活性，然后PBS沖洗3次，每次沖洗3min，并在顯微鏡下觀察5min。最后進行蘇木素復染，采用0.1%的鹽酸分化，并用自來水進行沖洗，藍化處理，得到切片經過梯度酒精的脫水并干燥，二甲苯洗脫到透明，使用中性樹膠進行封固，晾干后觀察。高倍鏡下選取9 個視野計數細胞，每張切片選擇5個高倍鏡視野(400×)，應用圖像分析系統進行定量灰度掃描后進行分析。根據陽性細胞數占同類細胞數的百分比評分：<25%為1 分，25%～50% 為2 分，51%～75%為3 分，>75% 為4 分。取兩項評分的乘積作為總積分，>5 分為陽性。

1.2.2RT-PCR檢測SLCmRNA及CCR7mRNA表達

得到的肺癌組織、肺良性病變患者正常肺組織及肺良性病變患者淋巴結組織進行磨碎，首先在200μLPCR管中配制25μL反應體系，然后在94℃溫度下預變性5min，再變性1min；52℃退火1min；72℃延伸1min，按照變性、退火、延伸步驟進行PCR擴增35次，最后72℃延伸10min。然后進行PCR相對基因表達分析，在所有PCR所檢測的的基因中，以RPL32為內參基因，按照2-ΔΔCT 方法[6]，以正常大白兔來源的組織RNA為對照，來計算相對基因表達。首先制備電泳膠，然后按照操作說明將制備好的電泳膠放入電泳槽，同時將PCR產物倒入，加入緩沖液，樣本混勻后放入電泳膠孔。PCR反應條件[7]：取5 μLPCR的產物，加點在紙上，然后使用6×上樣緩沖液，反復吸打使其混勻，然后進行電泳，100V下電泳20～30min，并在紫外燈下進行觀察，結果進行掃描保存。并計算SLC mRNA及CCR7mRNA的表達量。

1.2.3 相關性分析

收集患者的性別、年齡、淋巴結微轉移、腫瘤大小和分化程度等資料，分析SLC及CCR7的表達與性別、年齡、淋巴結微轉移、腫瘤大小和分化程度等的相關性。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 3組肺組織的SLC及CCR7表達

病例組與兩組對照組的SLC、CCR7的表達陽性率，具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組肺組織的SLC及CCR7表達的陽性率[n(%)]

2.2 3組肺組織的SLC mRNA及CCR7mRNA表達

病例組的SLC mRNA及CCR7mRNA的表達量明顯高于兩組對照組，具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組肺組織的SLC mRNA及CCR7mRNA表達

2.3 SLC及CCR7表達與淋巴結微轉移關系

SLC及其受體CCR7的表達與淋巴結微轉移有關(P<0.05)；但是SLC及其受體CCR7的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小和分化程度無關(P>0.05)。見表4。

表4 SLC及CCR7表達與淋巴結微轉移關系

3 討論

肺癌的微轉移是指肺癌在發生、發展的過程中一種表現，產生的腫瘤細胞會存活于淋巴結、血液循環、骨髓以及各種組織器官中，還沒有形成顯性的轉移結節，也不會在轉移部位出現任何臨床表現，使用常規檢查方法如影像學和臨床病理學等均難以發現的一種微量轉移[8]。雖然現階段的肺癌分期系統能夠較好地提示患者的預后情況，但對于I期的患者，其預后情況卻不盡相同。這種結果是否患者在術前出現了隱匿性腫瘤微轉移[9]。大量的研究證實，當腫瘤的直徑<3cm可能會出現淋巴結微轉移，進而導致預后結果較差的原因[10]，也可能是較早的發生遠處轉移及復發的重要因素[11]。

SLC是屬于CC類的趨化因子，SLC是由活化的T淋巴細胞和內皮細胞產生，在高內皮小靜脈和淋巴結T細胞區的高表達[12]。CCR7是SLC的高親合力的受體，主要存在于幼稚T細胞、B細胞和樹突狀細胞表面[13]。研究[14]發現SLC在腫瘤常見轉移部位呈現高水平表達，顯示SLC與CCR7共同參與了腫瘤的轉移與侵襲。SLC-CCR7生物學在細胞的轉移方面有一定的作用，并且可以調控其它趨化因子的分泌[15]。但是關于I期非小細胞肺癌SLC及其受體CCR7的表達與淋巴結微轉移關系未見報道，因此本研究具有一定創新性。

本研究的結果顯示肺癌組織中的SLC及其受體CCR7的表達均比肺良性病變患者正常肺組織及肺良性病變患者淋巴結組織高，而且相關分析認為SLC及其受體CCR7表達與淋巴結微轉移有關；與患者的性別、年齡、腫瘤大小和分化程度無關。這也說明了SLC及其受體CCR7表達在I期非小細胞肺癌中存在高表達，而且這種表達與I期非小細胞肺癌的淋巴結微轉移。

理論上手術后進行輔助治療對控制腫瘤細胞的亞臨床轉移和淋巴結微轉移的患者具有一定意義，但是篩選高危人群進行合理治療對患者的作用比較大。而I期非小細胞肺癌SLC及其受體CCR7的表達情況可以為此類患者進行判斷，從而確定該進行治療的患者，這對盲目的接受治療更有意義，這也正是本次研究的意義的重要性。

綜上所述，I期非小細胞肺癌SLC及其受體CCR7的表達為高表達，這種表達與淋巴結微轉移有關。