外源磷輸入對底泥砷污染香蒲根系分泌烴類物質的影響

杜崇宣 劉云根,2 王 妍 包寧穎 陳 天

（1.西南林業大學生態與環境學院，云南 昆明 650233；2.西南林業大學生態與環境學院云南省山地農村生態環境演變與污染防治重點實驗室，云南 昆明 650233）

砷（As）是一種具有強毒性的環境污染物[1]，廣泛應用于冶金、含As殺蟲劑、除草劑、木材防腐劑和飼料添加劑等，過量的As釋放到環境中，導致土壤和水體的As污染問題日益嚴重[2-3]。目前，土壤重金屬的修復方法主要有物理化學修復和生物修復，但是物理化學修復存在著易產生二次污染和工藝復雜等問題，而生物修復顯得更加的綠色環保，在重金屬的污染治理中得到廣泛應用。磷（P）和As同屬第Ⅴ族元素，自然界中往往共生，形成相似的P酸鹽（PO43-）和As酸鹽（AsO43-），兩者在土壤中存在競爭吸附關系[4]，在植物中主要表現為拮抗和協同效應[5]。植物對重金屬的污染修復作用主要源于根系，而根系分泌物在這個過程中發揮著至關重要的作用。同時，根系分泌物組分易受營養鹽水平或重金屬元素等因素影響，導致其功能和含量發生變化。因此，研究外源P輸入對As污染生境中植物根系分泌物的影響具有一定的科學意義。

植物在生長過程中由根系不同部位分泌產生的無機離子或小分子有機物統稱為根系分泌物。烴類是一種簡單的碳氫化合物，碳鏈結構穩定，較難降解，在自然界中廣泛存在，是植物根際微生物的重要碳源，已有研究表明，烴類物質在植物根系分泌物中所占比重較大[6]。目前，有關烴類物質的研究主要集中在原油污染土壤[7-9]、海洋溢油事故[10-11]、芳香烴類物質對人及動物的毒性等方面[12-13]，而有關植物根系分泌物烴類物質的研究相對較少。

香蒲（Typha angustifolia）是一種多年生或沼生草本植物[14]，廣泛分布于我國，其根系發達且生長迅速，在濕地生態系統中的作用一直受到關注[15-17]，香蒲對環境脅迫耐性較強，是國內外公認的濕地水生植物優勢品種[18-19]。目前關于香蒲的研究涉及香蒲根內生細菌群落多樣性[20-21]，香蒲對重金屬的吸收[22-23]及吸收途徑，等方面，而關于環境因子對香蒲根系分泌物的影響報道較少。因此，本研究擬通過土壤培育試驗探索不同外源P輸入對As污染底泥香蒲根系分泌烴類物質的影響，揭示濕地植物根系分泌物應對As和P交互作用所作出的應對措施，為重金屬污染地區植物修復技術提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試香蒲購自云南省昆明市富民縣香蒲種植基地(東經102°34′42″,北緯 25°12′49″)。土壤采自校園內無As污染紅土，采用多點混合法，風干后備用。試驗于2018年4月6日在溫室內進行。模擬試驗所用土壤基本性質由表1所示。

表1 供試土壤的基本性質Table 1 Fundamental properties of the tested soil

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤培養試驗

取回的土壤自然晾干、粉碎，過2 mm篩后備用。使用前將土壤與有機復合肥按體積比1∶2混合，使用黑色聚乙烯塑膠桶（直徑 25 cm,高 35 cm）作為濕地模擬裝置（共計15個），每桶裝入15 kg干土和10 L無菌水致淹水狀態并標記出每個濕地裝置的持水線高度。以Na2HAsO4·7H2O為As源，向模擬濕地裝置土壤中添加50 mg/kg As，攪勻，并將土壤至于常溫、黑暗環境中老化1.5個月。待土壤老化以后，每個濕地裝置移栽4株生長一致，苗齡為1個月的香蒲幼苗，以盆為重復，每個處理3個重復，共15個重復。設置空白對照CK1（底泥無As源添加，無外源P輸入），待植物正常生長1周后向濕地裝置中以溶液的形式分別添加CK2（0 mg/L）、低（0.2 mg/L）、中（2 mg/L）、高（20 mg/L）4個梯度的外源P污染，選用KH2PO4作為P源，定株培養60 d，培養時間為2018年4月13日—2018年6月13日，期間每隔1個星期向各濕地裝置中添加無菌水至持水線高度。

1.2.2 香蒲根系分泌物的收集

參考韋雪晶等[6]的方法并加以改進，將4株生長一致的植物從土壤中小心取出，并用去離子水沖洗根系4次，洗凈根部的土壤顆粒后用20%質量分數的H2O2溶液浸泡10 min，用去離子水洗凈根系后，將根系轉至盛有300 mL 0.5 mmol/L CaCL2溶液中，并保證根部處于避光條件下收集根系分泌物12 h。收集完成后，將收集好的浸提液定容至300 mL，過0.45 μm微孔濾膜。取浸提液加入分液漏斗與二氯甲烷按1∶1的體積比萃取3次，合并萃取液，取有機相到旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司，中國）濃縮蒸發，減壓濃縮至干后用2 mL色譜純二氯甲烷潤洗溶解有機相并過0.45 μm有機濾膜后裝入2 mL樣品瓶-20 ℃保存備用。

1.2.3 根系分泌物GC-MS分析

提取后的根系分泌物采用GC-MS（俊齊儀器設備有限公司，美國）測定。采用電子轟擊源，轟擊電壓70 eV，質量范圍從 30～600 m/z 掃描，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230 ℃。毛細管柱：HP-5 MS柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，柱溫50 ℃（保持 2 min），以6 ℃/min程序升溫至250 ℃（保持15 min）。載氣為氦氣，流量l mL/min，進樣量為l次。為消除實驗誤差，按照相同測定條件以萃取劑二氯甲烷作空白試驗。應用NiST08質譜數據庫，分析質譜圖，選取匹配度在90%以上的物質檢出并做進一步分析，確定各組分物質名稱。采用外標法進行定量分析，用各化合物標樣的5、10、20、40、80 mg/L為工作曲線，將系列檢測到各化合物峰面積帶入標準曲線計算濃度，各標準曲線線性相關系數（R2）為0.920 2～0.999 4，線性相關系數均在可接受的范圍內。

1.2.4 植物生長狀況及根系As的檢測

將洗凈的香蒲根系用吸水紙擦干根系表面的水分以后，用電子天平（精確到0.000 1 g）稱量鮮質量，用卷尺（精確到1 mm）測量根長，根系As的檢測采用三酸消解法[24]檢測。按公式（1）[25]計算根系耐性指數（TI）。

式中：Li為各處理組根的平均長度、Lc為對照組根系平均長度。

1.3 數據分析

采用SPSS 18.0和Microsoft Excel 2010軟件對實驗數據進行單因素方差和數據均值及標準差分析，采用Canoco 4.5對實驗數據進行RDA和PCA分析。

2 結果與分析

2.1 外源P輸入對底泥As污染香蒲生長及根系As含量的影響

由表2可知，不同外源P輸入對底泥As污染香蒲生物量的影響呈現出先增加，后減少的趨勢。與CK1相比，底泥As污染處理后，植物生物量顯著性增加（P＜0.05），且外源P以低濃度輸入，植物生物量達到峰值后便逐漸降低，中濃度外源P輸入植物生物量沒有顯著性變化，高濃度外源P輸入則顯著抑制植物生長（P＜0.05）；底泥As污染，不同外源P輸入下，香蒲均能正常生長，并且長勢良好，可知香蒲對環境因子的改變有較強的適應能力。

表2 外源P輸入下底泥As污染香蒲的生物量Table 2 Biomass of T.angustifolia in As contaminated sediment condition under exogenous P input g/盆

由表3可知，底泥As污染處理后，隨著外源P的添加，香蒲根系As濃度先降低后增加，即低濃度外源P輸入，植物根系As濃度下降，但不顯著，中高濃度外源P輸入，植物根系As濃度顯著上升（P＜0.05）。植物根部是作為最先接觸土壤重金屬的器官，可以利用根長作為表征植物重金屬舒耐性的指標[26]，由TI可知，在受到底泥As污染處理后，TI顯著增加（P＜0.05），說明底泥As污染處理并沒有抑制香蒲生長，反而起到一定的促進作用。與CK2相比，不同外源P處理后，低濃度外源P輸入TI有所增加，但不顯著，中、高濃度P處理TI開始降低，這表明低濃度外源P輸入促進植物生長，而中、高濃度外源P輸入開始抑制植物生長。

表3 外源P輸入下底泥As污染香蒲根系As濃度及TITable 3 Concentration and tolerance index of T.angustifolia roots in As contaminated sediment condition under exogenous P input

2.2 外源P輸入對底泥As污染香蒲根系分泌烴類物質種類的影響

由圖1a所示，香蒲根系分泌的烴類物質中烷烴類物質的種類均多于烯烴類物質。由圖1b可知，當外源P以不同濃度輸入時，根系分泌的特有烷烴類物質便明顯高于特有烯烴類物質；香蒲根系分泌的烴類物質種類均表現為處理生境高于常規生境，當外源P以低濃度輸入達到峰值后便逐漸降低；對烷烴類物質而言，CK2與CK1相比，物質種類明顯增加，與CK1相比，外源P以不同濃度輸入時，物質種類均明顯增加，與CK2相比，外源P以不同濃度輸入時，除外源P以低濃度輸入時，物質種類明顯增加外，其余均無明顯變化；烯烴類物質的變化趨勢略不同于烷烴類與烴類物質，CK2與CK1相比，物質種類明顯增加；與CK1相比，外源P以不同濃度輸入時，物質種類均明顯增加，與CK2相比，外源P以不同濃度輸入時，均無明顯變化；底泥As處理且外源P以不同濃度輸入時，烷烴類和烯烴類物質物質種類無明顯變化。可見香蒲根系分泌的烴類物質中，烷烴類物質的種類多于烯烴類物質的種類；外源P輸入和As污染生境會促進香蒲根系烴類物質種類的分泌；底泥As處理且外源P以不同濃度輸入時，根系分泌的烴類物質呈現出先增加后降低的趨勢。

圖1 外源P輸入對底泥As污染香蒲根系分泌烴類物質及特有烴類物質種類的影響Fig.1 Effects of exogenous P inputs on the secretion types of hydrocarbons and special hydrocarbons from the roots of T.angustifolia under As contaminated sediment condition

2.3 外源P輸入對底泥As污染香蒲根系分泌烴類物質含量的影響

由表4可知，香蒲根系分泌共有烴類化合物中，從種類上來看，烷烴類化合物表現出了極大的優勢地位，從化合物結構特征上來看，鏈狀結構占優勢地位，在檢測到的20種共有烴類化合物中，共17種烷烴類化合物，其余3種為烯烴類；香蒲根系分泌的17種共有烷烴類化合物中，有14種化合物呈鏈狀結構，僅3種化合物呈環狀結構；14種鏈狀烷烴化合物中有11種正構烷烴，僅有3種支鏈烷烴，而檢測到的烯烴都是支鏈烯烴。可見，香蒲根系分泌的共有烴類物質以簡單的鏈狀正構烷烴類化合物為主。底泥As污染生境中，不同濃度外源P處理顯著促進香蒲根系烴類物質分泌（P＜0.05）。與CK1相比，CK2（P＜0.05）除環狀烷烴沒有顯著性變化外，其余化合物濃度均顯著增加（P＜0.05），不同外源濃度外源P處理后，所有烴類化合物濃度顯著增加（P＜0.05），且顯著高于CK2（P＜0.05）。可見As、P雙因子交互處理比底泥As單因子處理更能促進香蒲根系烴類物質分泌。

底泥As處理且外源P以不同濃度輸入顯著促進香蒲根系烴類物質的分泌。與CK1相比，絕大多數烴類化合物濃度均顯著升高（P＜0.05）。由圖2a可知，烯烴類物質在外源P以低、中、高濃度輸入平均增長百分比均高于烷烴類物質；烷烴類物質不同結構化合物在底泥As處理且外源P以低、中、高濃度輸入平均增長百分比均表現為正構烷烴＞環狀烷烴＞支鏈烷烴。與CK2相比，大部分烴類物質濃度均顯著升高（P＜0.05）。烯烴類物質在底泥As處理且外源P以低、中、高濃度輸入平均增長百分比均低于烷烴類物質；烷烴類物質不同結構化合物在底泥As處理且外源P以低、中濃度輸入平均增長百分比均表現為正構烷烴＞環狀烷烴＞支鏈烷烴，當底泥As處理且外源P以高濃度輸入平均增長百分比均表現為支鏈烷烴＞環狀烷烴＞正構烷烴。可見As和P交互處理比底泥As單因子處理更易促進香蒲根系烴類物質的分泌；底泥As處理易促進烯烴類物質的分泌，而As和P交互處理則促進烷烴類物質分泌；不同結構烷烴類化合物的平均增長速度為正構烷烴＞環狀烷烴＞支鏈烴。

表4 外源P輸入下底泥As污染香蒲根系分泌烴類物質共有成分濃度Table 4 Common component concentration in hydrocarbons secreted by roots of T.angustifolia in As contaminated sediment condition under exogenous P input mg/L

圖2 不同種類和結構烴類物質與CK1及CK2相比平均增長百分比Fig.2 Average percentage increase in hydrocarbons of different types and structures compared to CK1 and CK2

由表5～6可知，當香蒲受到逆境脅迫時，香蒲根系分泌的特有烴類物質以支鏈烴類為主。由表5可知香蒲根系分泌物中共檢測出19種特有烷烴類化合物，在香蒲根系分泌的19種特有烷烴類化合物中，有15種是支鏈的鏈烷烴，有3種為正構烷烴，只有1種呈環狀結構；由表6可知香蒲根系分泌物中共檢測出11種烯烴類化合物，在香蒲根系分泌的11種特有烯類化合物中，有10種均呈鏈狀結構，僅有1種環狀結構存在，在10種鏈狀結構中，9種均為支鏈烯烴。

表5 外源P輸入下底泥As污染香蒲根系分泌烷烴類物質特有成分濃度Table 5 Concentration of special components in secretion of alkanes from T.angustifolia roots in As contaminated sediment condition under different exogenous P input mg/L

表6 外源P輸入下底泥As污染香蒲根系分泌烯烴類物質特有成分濃度Table 6 Concentration of special components in secretion of olefins from T.angustifolia roots in As contaminated sediment condition under different exogenous P input mg/L

2.4 底泥As處理香蒲根系分泌烴類物質與環境因子PCA和RDA分析

采用主成分分析法（PCA），將不同外源P處理作為環境因子，將香蒲根系分泌的烴類共有組分作為研究對象繪制線性排序圖對不同外源P輸入香蒲根系分泌的共有烴類化合物進行分析。由圖3a可知，高濃度外源P環境因子附近的箭頭集中較多，其次為低濃度，次之為中濃度，最后為CK2，因此，底泥As污染生境中，不同外源P輸入對香蒲根系分泌烴類物質濃度的影響為高濃度＞低濃度＞中濃度＞CK2。采用冗余分析法（RDA），對根系分泌烴類物質濃度、種類與植物根系As富集濃度和根系耐受指數分析可知，絕大多數箭頭穿過圖3b紅色圓圈，只有5,5-二乙基十七烷一種化合物穿過藍色圓圈，十四烷不在圈內，這說明絕大部份烴類物質濃度及種類與植物根部As富集濃度呈顯著正相關關系（P＜0.05），同樣，由圖3c可知，絕大部份烴類物質濃度及種類與TI呈顯著正相關關系（P＜0.05）。

圖3 底泥As處理香蒲根系分泌物與外源P輸入PCA 和RDA 分析Fig.3 Analysis of PCA and RDA between root exudates and exogenous P input in As contaminated sediment condition

3 結論與討論

根系分泌物是根系對土壤環境生化適應的產物，植物在生長過程中，根系從環境中攝取養分的同時，也向環境中分泌質子和離子，并釋放大量有機物，根系分泌物的影響因素是多方面的，任何影響植物生長和生理的因素均會影響根分泌物的數量和種類[27-28]。本研究的結果也進一步印證了這一觀點，As和P這2個環境因子均會對植物生長和生理產生影響，從而導致根系分泌烴類物質的數量和含量發生了改變，由圖3c也可知，根系分泌烴類物質濃度和種類與TI，即植物根系生長狀況呈顯著性正相關關系。As是植物生長不需要的有毒痕量元素[29]，但是，也有相關研究表明低濃度的As可以促進植物的生長[30]，由表2和表3可以看出本研究也得出了相同的結論。這可能是因為底泥50 mg/kg As處理時，底泥中存在著大量的AsO43-，而PO43-和AsO43-結構相似，它們在土壤中共同競爭吸附點位，游離的AsO43-將底泥中原來被土壤膠體吸附的生物有效性較低的PO43-置換出來提高了土壤中P的有效性，促進了香蒲對P的吸收，刺激了香蒲的生長發育，從而顯著增加香蒲根系烴類物質種類與含量的分泌。P和As為同族元素，As酸鹽和P酸鹽具有相似的理化性質，二者不僅在土壤顆粒表面和根系的自由空間競爭吸附位點，而且競爭細胞膜上共同的吸收轉運系統[31-33]，由表3可推測當外源P以低濃度輸入時，As與P在植物中主要表現為拮抗作用，因此在一定程度上會減少As的吸收，而外源P以中高濃度輸入時，土壤溶液的P酸鹽會競爭土壤顆粒表面As酸鹽的吸附位點，提高As的生物有效性，最終增加了植物對As的吸收，從而抑制香蒲生長。因此香蒲根系分泌的烴類物質種類呈現出先增加后降低的趨勢。

相關研究表明，微生物降解有機物的順序為正構烷烴＞異構烷烴＞開環類的異戊二烯烷烴＞環狀萜類化合物＞甾族化合物[34]，由圖2可知，環境因子對不同結構烷烴類物質的影響（平均增幅）為正構烷烴＞環狀烷烴＞支鏈烷烴，這可能與微生物的降解有關。由表2可知，P是植物生長發育所必需的營養元素，一定濃度的P可以促進植物的生長，而隨著P濃度的升高，超過了一定濃度，就會抑制植物的生長發育。許多研究發現，植物在受到一定有害物質毒害時，根系分泌物組成成分的濃度會發生變化，增加根系分泌物中部分組分的產生和累積[35]，本研究可知，與常規生境相比，逆境脅迫促進烴類物質種類和濃度的增加，且同種物質不同結構，或是不同物質的增幅是不一致的，這可能是植物對有害物質毒害的一種應激反應，植物根系通過增加或減少根系分泌物的種類或是含量，又或者是某一類化合物濃度來調節根際微域環境，使得根際微域環境利于有害物質的分解。由圖3b冗余分析結果也可以驗證這個結論，香蒲根系分泌烴類物質的濃度和種類與根系As富集濃度呈顯著正相關關系。至于逆境脅迫下，香蒲根系分泌的烴類物質為什么以支鏈烷烴為主及烯烴類物質的來源與作用研究較少，有待進一步研究。

根系分泌物是植物根系的次生代謝產物，對比環境因子脅迫前后根系次生代謝物質組成發現，脅迫環境香蒲根系次生代謝物質種類發生了很大變化。由圖1a可知與CK1相比較，底泥As處理，不同外源P輸入分別新檢測出7、11、8、7種化合物，并且由表4～6中可知，香蒲在正常生境下的根系分泌烴類物質中以正構烷烴化合物為主，而當植物受到環境因子的脅迫時，香蒲根系便會開始大量分泌支鏈烷烴和支鏈烯烴化合物，從中可以推測，環境因子脅迫能夠誘導香蒲根系次生代謝途徑發生改變，導致根系次生代謝物質成分發生改變，以抵御環境因子的脅迫。其中，變化最顯著的就是支鏈烷烴和支鏈烯烴化合物，處理前香蒲根系分泌物中檢測到的支鏈烷烴和支鏈烯烴化合物較少，主要以正構烷烴化合物為主，處理后，香蒲根系分泌物中新檢測到了大量支鏈烴和支鏈烯烴化合物。

根分泌物的釋放與細胞膜的選擇透性有關[36]，當膜完整性和選擇性受損時，膜的透性就會增加，有機物從活體中大量釋放，并引起不正常的泄漏[37]。由圖3a可知，高濃度外源P輸入對香蒲根系分泌烴類物質濃度的影響最大，相關研究表明[38]，污染物對植物的毒害與自由基有關，植物在逆境脅迫下細胞內自由基的代謝平衡被破壞從而導致自由基的產生，過剩自由基的毒害之一是引發或加強膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統的傷害，嚴重時可導致植物細胞死，可見當外源P以高濃度輸入時，植物體內會產生大量自由基，影響了細胞膜的通透性，因此高濃度外源P輸入對香蒲根系分泌烴類物質濃度的影響最大。