鹽脅迫對石榴生長與生理生化特性的影響

董建梅 劉翠玉 趙玉潔 苑兆和

（1.南京林業大學南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業大學林學院，江蘇 南京 210037）

隨著人口快速增長，越來越多的荒地將被開墾作為耕地，干旱地區的灌溉農業，水資源管理不合理，土壤鹽漬化問題越來越突出，嚴重制約了農業的可持續發展[1]。據報道，全球超過8×109hm2的土地正遭受著鹽脅迫的影響，占全球陸地總面積的6%[2]。中國鹽堿土占全國可利用土地面積的4.88%，總面積約為3.6×107hm2，主要分布在東北、華北、西北及沿海地區[3-4]。鹽堿土是中國重要的后備土地資源，由于不良的理化性質，嚴重影響了生于其上的作物，可致其減產或死亡，未能被充分利用[5]。改造治理以及合理開發利用鹽漬土壤，對全球的生態和經濟具有重要的意義[6]。開展果樹的耐鹽性研究，篩選出抗鹽品種種植于鹽堿地，既可利用生態修復改善土壤鹽漬化問題，又可為當地的種植戶帶來經濟收益。

探究鹽脅迫環境下，植物的生長和生理生化特性的影響，是選育耐鹽作物的重要基礎。鹽脅迫對植物生理生長方面的影響，主要包括膜質結構、光合作用、呼吸作用和代謝生理等方面。鹽脅迫使植物體內積累了較多的活性氧（ROS），對植物體造成不同程度的傷害甚至死亡，滲透調節、離子的區域化、改變光合途徑、清除活性氧、調節植物內源激素等途徑可應對環境造成的鹽害脅迫，其中抗氧化酶系統能夠減緩膜脂過氧化作用的危害[7-10]。目前，植物耐鹽生理研究多以中性鹽NaCl脅迫為主，植物耐鹽閾值的研究越來越受到關注。孫曉剛等[11]在不同NaCl脅迫對‘吉美’海棠（Malus spectabilis）的生長和生理特性的影響試驗中指出，在低濃度（50 mmol/L）脅迫下，‘吉美’的生長和生理活動未受到顯著影響，而在200 mmol/L時，‘吉美’海棠停止生長，出現死亡跡象。孔芬等[12]指出，200 mmol/L是芍藥（Paeonia lactiflora）耐受NaCl濃度的極限，超過此濃度，造成不可逆的損傷，甚至死亡，而在低濃度（50～100 mmol/L）下，植株生長未受到明顯的影響。

石榴（Punica granatum）為千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（Punica）[13]，適應性強，耐鹽堿較強的落葉果樹之一[14]，具文化、生態、經濟和藥用價值[15]。石榴籽粒象征著團結，多子多福[16]；除了可以直接食用外，石榴還可加工成果汁、果酒、果醬，調味品，化妝品等，賦予了極大的加工潛力[17]。石榴含有的一些生物活性成分，如有機酸，多酚，花青素和抗氧化物等，能夠有效地改善心血管健康，防治糖尿病，以及抗癌、抗菌、抗過敏等[18-20]。消費群體不斷增加，產業發展迅速。國內外關于鹽脅迫的研究多見于作物的生長、光合和生理特性以及基因方面，在果樹尤其是石榴抗氧化酶研究中甚是少見[21-22]。本研究旨在探究不同NaCl濃度脅迫下石榴生長發育特性，活性氧的產生、抗氧化酶活性，以及抗氧化物質含量的影響，以期緩解鹽脅迫產生氧化傷害的可能性，為生產實踐應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在南京林業大學的人工氣候室進行盆栽試驗。氣候室光照培養，15 h（晝）/9 h（夜），晝/夜溫度為25 ℃/18 ℃，空氣相對濕度為70%。石榴以‘泰山紅’為研究對象，該品種具有皮薄，質脆，口感好，風味佳，耐貯運，豐產，適應性強等優點。

于2017年10月11日，選擇1年生硬枝，修剪成10～15 cm，扦插于盆（32 cm×25 cm）中，盆土基質為V（珍珠巖）∶V（草炭土）=1∶1的混合。于2017年10月10日將鮮果剝籽放入水池搓洗，加入100 mL 98%的濃H2SO4，以剛剛淹沒種子為宜，用玻璃棒攪10 s左右，當發現開始有種子變黑，倒掉濃H2SO4，清水沖洗3～4次后播種于含細河沙的穴盤中。20 d的時候長出2片子葉，株高5 cm左右時移栽于盆（32 cm×25 cm）中，盆土基質為V（珍珠巖）∶V（草炭土）=1∶1的混合。實驗材料置于溫室中，每3 d澆1次水，每隔7 d澆1次Hoagland營養液。

1.2 試驗設置

將生長6個月的實生苗（株高30 cm左右），用不同NaCl濃度（0、100、200 mmol/L）的1/2 Hoagland營養液處理。試驗設置3個重復，每重復3盆，5株/盆（根據苗子的大小，確定合理的生長空間）。

選擇健壯且長勢一致的6個月生扦插苗（株高30 cm左右），用含不同NaCl濃度（0、100、200 mmol/L）的1/2 Hoagland營養液處理，試驗設置3個重復，每重復5盆，2株/盆。

每3 d上午10：00澆鹽水1次至飽和，滲出的水回澆，防止鹽分流失，隔6 d用清水沖洗土壤（洗凈殘留的鹽分，以防鹽分積累）。處理12 d后觀察2種植株的生長情況，分別統計鹽害率和鹽害指數，將每棵石榴苗的根、莖、葉洗凈分類收集，放入液氮中，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.3 指標測定

采用王業遴等[23]的鹽害輕重分級標準，按公式（1）～（2）計算鹽害率（P）、鹽害指數（D）；將石榴樣品的根、莖、葉于105 ℃烘箱中殺青15 min，70 ℃烘干至恒質量后稱量，計算單株生物量與根冠比。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光化還原法[24]測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法[25]測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法[26]測定；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照張治安等[27]的方法測定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法[28]；可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250比色法[29]測定；谷胱甘肽（GSH）參照趙旭東等[30]的簡便測定法；超氧陰離子（O2·－）采用羥胺氧化法[31]測定。

1.4 數據處理

采用Excel 2010預處理數據后，用SPSS 17.0進行ANOVA分析和Duncan多重比較（P＜ 0.05），用Origin 8.5作圖，進行分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對石榴生長的影響

由表1可知，隨著NaCl濃度增加，實生苗和扦插苗的鹽害率和鹽害指數均顯著升高（P＜0.05），且在NaCl濃度達200 mmol/L時，鹽害達到100%，實生苗的鹽害指數較扦插苗的高，最大鹽害指數為0.47，說明實生苗比扦插苗更易被鹽害。實生苗的根冠比隨著鹽濃度的增加呈先降后升趨勢，而扦插苗中的根冠比隨著鹽濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），且扦插苗的根冠比比實生苗的高，根冠比最大值為0.47。實生苗的單株生物量隨著鹽濃度的升高而顯著下降（P＜0.05），在濃度為200 mmol/L時，單株生物量為1.04 g，說明高濃度的鹽脅迫抑制了石榴實生苗的生長；扦插苗的單株生物量隨著鹽濃度的增加而呈先升后降的趨勢，且高于實生苗，單株生物量最高值為100 mmol/L的扦插苗中（4.94 g）。

表1 不同NaCl濃度對石榴鹽害率、鹽害指數、根冠比和單株生物量的影響Table 1 Effects of different NaCl concentrations on salt damage rate,salt damage index,root/shoot ratio and the single biomass in P.granatum

2.2 鹽脅迫對石榴活性氧及MDA含量的影響

由圖1可知，O2·－凈增長率隨著鹽濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），與空白處理（0 mmol/L）相比，NaCl處理后石榴實生苗的根、葉的O2·－凈增長率均較扦插苗高；且在高濃度（200 mmol/L）鹽脅迫環境下，葉的O2·－凈增長率比根高，最大值為42.30%。說明鹽脅迫環境下，超氧陰離子自由基積累速率加快，實生苗中葉的積累量更明顯。

MDA是膜脂過氧化作用的最終產物之一，細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度可通過其含量來反映[32]。本研究發現，石榴MDA含量隨著鹽濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），實生苗的根的MDA含量顯著高于葉（P＜0.05），扦插苗與之相反，對于根而言，實生苗的MDA含量顯著地高于扦插苗的（P＜0.05）；同一鹽濃度脅迫下，2種苗的葉的MDA含量差別不大，MDA含量最大值位于高鹽濃度（200 mmol/L）實生苗的根中（32.08 mmol/g）。

圖1 不同NaCl濃度對石榴O2·－凈增長速率和MDA含量的影響Fig.1 Effects of different NaCl concentrations on net growth rate of O2·－ and MDA content in P.granatum

2.3 鹽脅迫對石榴抗氧化酶活性的影響

由表2可知，隨著鹽濃度的升高，SOD、CAT、POD、APX活性均顯著增加（P＜0.05）。不同的苗木，不同的組織中，抗氧化酶活性的差異顯著（P＜0.05）。NaCl處理后石榴實生苗葉中的SOD活性比扦插苗葉片中SOD活性高，200 mmol/L時分別達到1 542.82、1 269.64 U/(g·min)，不同處理下，扦插苗中根的SOD活性較實生苗中根的高。鹽脅迫下，石榴實生苗和扦插苗葉片中的CAT活性均比根部較高，扦插苗根、葉中CAT活性略高于實生苗的（除200 mmol/L下扦插苗根中862.5 U/(g·min)外），CAT活性最高為扦插苗的葉中（1 283.33 U/(g·min)）。

表2 不同NaCl濃度對石榴酶活性的影響Table 2 Effects of different NaCl concentrations on enzyme activities in P.granatum U/(g·min)

石榴實生苗和扦插苗在鹽脅迫環境下，葉片中的POD活性較根的高，實生苗根中的POD活性比扦插苗的根中POD活性高，扦插苗葉片中的POD活性比實生苗的葉片高，POD活性最高在200 mmol/L的鹽濃度下的扦插苗葉片中產生，為438.44 U/(g·min)。石榴扦插苗葉片中的APX活性顯著地高于實生苗的葉片（P＜0.05），且葉片中的APX活性較根高，說明扦插苗的葉片能夠產生大量的APX，APX活性最大值為223.67 U/(g·min)。

2.4 鹽脅迫對GSH和可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，GSH含量隨著鹽濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），在鹽脅迫環境中，扦插苗的GSH含量顯著地高于實生苗的（P＜0.05），其根中GSH含量顯著地高于葉（P＜0.05），最大值為高鹽脅迫下（200 mmol/L）的扦插苗的根中，為773.16 mmol/g。石榴的可溶性蛋白含量均隨NaCl濃度的增加而升高，差異顯著（P＜0.05），葉的可溶性蛋白含量高于根的，實生苗的根的可溶性蛋白含量顯著地高于扦插苗的根（P＜0.05）；葉與之相反，可溶性蛋白含量最高值為897.23 μg/g，為NaCl濃度200 mmol/L的扦插苗的葉中。

圖2 不同NaCl濃度對石榴GSH和可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on GSH and soluble protein content in P.granatum

2.5 各指標間的相關性分析

由表3可知，鹽脅迫下石榴O2·－凈增長率與MDA和CAT含量呈極限著正相關（P＜0.01），與POD含量呈現顯著正相關（P＜0.05）；MDA與其他指標（除O2·－凈增長率之外）均無顯著相關性；GSH含量僅與APX含量呈現顯著正相關（P＜0.01）；SOD、CAT、POD、APX和Pro含量兩兩之間均呈極限著正相關（P＜0.01）。說明在鹽害環境中，O2·－凈增長率加快，MDA含量增加，各指標相互作用來應對鹽脅迫逆境。

表3 鹽脅迫下石榴苗木指標間的相關性分析Table 3 The correlation analysis of indexes of P.granatum seedlings and cuttings under salt stress

3 結論與討論

單株生物量、鹽害率和鹽害指數反映植物的鹽脅迫的重要形態特征，也是判斷其耐鹽性大小最直觀的指標。在本試驗中，隨著NaCl濃度的升高，鹽害率和鹽害指數均上升，實生苗單株生物量下降，在鹽濃度為200 mmol/L時，鹽害率達到100%，說明鹽脅迫抑制了石榴幼苗的生長，在Elagamy等[33]試驗中發現鹽脅迫也能抑制石榴果實的生長，與前人研究鹽脅迫對鵝耳櫪（Carpinus turczaninowii）[34]、銀水牛果（Shepherdiaargentea）[35]、沙 棘（Hippophae rhamnoides）[36]生長抑制一致。但也有研究發現低鹽濃度對植物的生長有促進作用，如海濱錦葵（Kostelezkya virginica）[37]、弗吉尼亞櫟（Quercus virginiana）[38]、薊（Cirsium japonicum）[39]等，相似的是石榴扦插苗在100 mmol/L時的NaCl脅迫下生物量略有增加。石榴在鹽脅迫下實生苗和扦插苗的差異說明，實生幼苗比較幼嫩敏感，更容易受到鹽害損傷。

鹽害環境下，活性氧積累，引發或加劇了膜脂的過氧化作用，膜系統遭到破壞，導致組織結構和細胞區隔化喪失[40-41]。本研究發現凈O2·－增長率隨著土壤鹽濃度的增加而升高，說明石榴在鹽脅迫下產生了大量的活性氧，這與付晴晴等[42]對不同葡萄（Vitis vinifera）株系葉片O2·－產生速率一致。本試驗發現隨著鹽濃度含量的升高，石榴根、葉組織中MDA含量增加，說明鹽脅迫加重了膜脂的過氧化損傷。

活性氧酶促清除劑、抗氧化物質能夠平衡活性氧的毒害[43]。Na+過量積累可誘發氧化脅迫，進而增強SOD活性，使其超表達，應對逆境，SOD作為抗氧化的第1道防線，可清除超氧化物自由基，并將其轉化為H2O2[44-45]。CAT作為清除H2O2的最有效的酶，在處理初期活性最高，而POD和APX在處理后期才起作用[46]。GSH通過誘導增強植物的滲透調節能力和清除活性氧的酶促系統的防御能力，降低受到的氧化脅迫和削弱膜脂過氧化程度、保護膜結構，緩解了鹽脅迫的抑制作用[47]。同時，可溶性蛋白作為一種重要的有機滲透調節物質，也能夠緩解鹽害[48]。本研究中，隨著鹽濃度的升高，可溶性蛋白含量增加，SOD、CAT、POD、APX活性提高，GSH含量上升，這與劉翠玉等[14]、Liu等[49]其他石榴品種的研究結果一致，說明 ‘泰山紅’同其他石榴一樣，具有一定的耐鹽性[50-51]，且各氧化酶發揮活性氧清除功能，緩和鹽脅迫危害。另外，研究發現 ‘泰山紅’的不同苗木類型在抗鹽能力方面有顯著差異，蔣建平[52]也在泡桐中發現實生苗和扦插苗的耐鹽極限存在差異，前者耐鹽極限為0.2%～0.3%，后者耐鹽極限為0.25%，常越霞[53]以白蠟（Fraxinus chinensis）為材料，發現實生苗的抗鹽性大于扦插苗，本試驗發現扦插苗的抗鹽性強于實生苗，這可能是因為材料生長狀態不同，石榴實生苗比較幼嫩更易發生鹽害的緣故。

通過研究鹽脅迫下石榴的生長發育特性，發現石榴具有一定的抗鹽性，但高鹽濃度脅迫對石榴生長造成了嚴重的危害，本試驗也存在一些局限，如通風狀況不夠良好，人工光照代替自然光等。下一步將在鹽濃度0～200 mol/L范圍內，增加多個濃度梯度，找出鹽分濃度閾值，為石榴在鹽堿地區種植和栽培提供科學依據，且在自然條件下對其進一步驗證，全面系統的研究石榴的耐鹽性。