文昌錐SRAP-PCR體系優化及有效引物篩選

孫秀秀 陳加利 楊立榮 云 勇 戚華沙 鄭道君

（海南省農業科學院熱帶園藝研究所，海南省農業科學院海南省熱帶特種經濟植物種質資源創新利用重點實驗室，海南 海口 571100）

文昌錐（Castanopsis wenchangensis）俗稱“杠酸”“油酸”，屬殼斗科錐屬植物，是海南特有種，僅分布在海南島東北部的文昌少數地區。野外調查結果發現，文昌錐現存種群僅有8個，個體數量不超過1 000株且大部分為成年老樹，屬于海南特有極小種群，急需保護。文昌果實口感好，淀粉含量高（淀粉含量60%左右），營養價值豐富，是較好的淀粉植物，在海南北部，尤其是文昌和海口地區，食用歷史悠久，市場銷價在30元/kg，具有較好的特色產品開發潛力。文昌錐分布地為沙地且干旱，屬常綠季雨林，該群落中還生長著許多地區特有錐屬植物，如海南島特有種海南錐、海南島文昌北部特有植物瓊北錐、波葉錐、平昌錐和毛果錐等極小種群[1-2]，生態環境較為脆弱。文昌錐耐干旱貧瘠，根系發達，樹木高大，是群落的優勢種之一，對穩定群落結構和生態環境有重要作用。系統研究文昌錐種群生態學、生殖生態學、保護遺傳學，對揭示文昌錐種群進化歷史、有效保護該種群和種群恢復，以及穩定脆弱的海南島東北部常綠季雨林生態具有重要意義，但目前還未見有文昌錐資源的研究報道。

相關序列擴增多態性（SRAP）是2001年由Li和Quiros開發的一種新型PCR標記技術。該標記通過獨特的雙引物設計擴增開放閱讀框（ORFs）的特定區域，上游引物對外顯子進行特異擴增，下游引物對內含子區域和啟動子區域進行特異擴增，由于個體差異而產生多態性[3]。該標記具有簡便高效、重復性好、易測序、多態性高等特點。目前已成功地應用于植物種群遺傳多樣性與遺傳結構分析[4-7]、遺傳圖譜的構建[8-9]、重要性狀的標記[10]以及相關基因的克隆等方面[11]。但目前關于SRAP標記應用于殼斗科錐屬植物資源的研究較少。

本研究擬采用單因素與正交試驗相結合的方法對影響文昌錐SRAP標記反應體系的因素進行分析，率先優化建立文昌錐SRAP反應體系，篩選獲得有效SRAP引物，為SRAP標記應用于文昌錐種群進化與保護遺傳學研究提供參考，也為其本地區特有錐植物極小種群的相關研究提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料為LFT-01、BC-02和BC-20，其中LFT-01采自海南省文昌市公坡鎮龍飛頭文昌錐居群，BC-02和BC-20采自海南省文昌市昌灑鎮寶彩村文昌錐居群。取健康葉片用硅膠干燥保存備用。

1.2 主要試劑和儀器

試驗用的TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×TaqBuffer（含Mg2+）、100 bp DNA Ladder Marker由南京諾唯贊生物技術有限公司提供，SRAP-PCR反應引物采用Li和Quiros[3]設計的引物序列，由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

1.3 基因組DNA的提取

采用FOREGENE試劑盒提取文昌錐的葉片DNA。紫外分光光度計檢測基因組DNA的純度和濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量，將葉片所獲的基因組DNA樣品濃度稀釋到20 ng/μL備用。

1.4 SRAP-PCR反應程序設置

反應體系為20 μL，在PCR儀（Heal Force T960）上進行。初始反應為2×PCR buffer 2 μL，TaqDNA聚合酶2 U，dNTPs 0.25 mmol/L，引物濃度0.4 μmol/L和模板DNA 30 ng，用ddH2O補足到20 μL。

反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環；然后在94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物放于4 ℃保存。

1.5 SRAP-PCR反應體系的優化與建立

1.5.1 單因素試驗設計

以LFT-01基因組DNA為模板，選用引物組合Me8-Em2（Me8：TGAGTCCAAACCGGACC；Em2：GACTGCGTACGAATTTGC；退火溫度：54 ℃），對影響SRAP-PCR的主要因素（DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶）進行單因素實驗（表1），保持其他因素不變的情況下變換一種因素進行擴增，篩選適宜的濃度范圍用于正交試驗。

1.5.2 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，篩選出DNA、引物、dNTPs和TaqDNA聚合酶4個主要影響因素的適宜的濃度范圍，進行L16（45）方案的正交試驗，確立最優反應體系。利用參照鄭道君等[12-13]的直觀分析法，根據擴增條帶的清晰度和豐富度對每個組合的擴增結果進行打分，最優擴增結果的為16分，最差的為1分。分別進行2次獨立計分，取2次的平均數。進行極差R值分析。

表1 SRAP-PCR單因素試驗設計Table 1 SRAP-PCR single factor test design

1.6 SRAP-PCR有效引物篩選和反應體系驗證

基于上述優化建立的反應條件，以LFT-01的基因組DNA為模板，對100對SRAP引物組合（正向引物10條，反向引物10條，正反引物相互組合成100對引物）進行初選（表2），從中選擇擴增3條以上產物的引物用于進行多態性引物評價和反應體系穩定性驗證。

表2 SRAP引物序列Table 2 Primer sequences used in SRAP analysis

基于上述優化建立的反應條件，以3份地理距離相差較遠的文昌錐資源（LFT-01、BC-02、BC-20）的基因組DNA為模板，以多態性比率（PPB）為主要評價標準，對初選獲得的SRAP引物對進行多態性引物評價，并進行反應體系穩定性驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 DNA用量對SRAP-PCR反應體系的影響

研究結果表明，文昌錐基因組DNA的濃度對SRAP-PCR擴增影響差異顯著。

圖1中，DNA用量為2.5～20 ng（泳道2～4）時擴增條帶豐富且清晰穩定，而后隨著DNA用量的增加，擴增強度和擴增條帶等擴增效率方面逐漸下降，在7泳道和8泳道（DNA用量50 ng和60 ng）僅擴增獲得1條400 bp的產物，在9泳道和10泳道（DNA用量80 ng和100 ng）沒有擴增產物。可見，文昌錐基因組DNA的用量越多，對SRAP反應效率就越差。經初選，確定2.5 ～20 ng為SRAP-PCR的適宜DNA濃度范圍，可用于正交試驗。

2.1.2 引物濃度對SRAP-PCR反應體系的影響

不同引物濃度對文昌錐SRAP-PCR反應體系影響的結果如圖1所示。在本試驗設計的濃度范圍內，隨著引物濃度的增加，擴增產物從無到有，其中，濃度為0.025 μmol/L時無擴增產物；當引物濃度為0.05 μmol/L時僅擴增一條大于1 500 bp的產物；最終在0.6 μmol/L及以上濃度（泳道17～20）時達到穩定，擴增條帶多且條帶清晰。因此，選擇引物濃度范圍0.6～1.2 μmol/L做為正交試驗設計的適宜濃度。

圖1 DNA模板用量和引物濃度對SRAP-PCR反應體系的影響Fig.1 Effect of template DNA concentration and primer concentration on SRAP-PCR reaction system

2.1.3 dNTPs濃度對SRAP-PCR反應體系的影響

dNTPs是PCR擴增反應的原料，其濃度直接影響PCR的擴增產物[14-16]。在本試驗中，dNTPs濃度低于0.1 mmol/L及以下濃度時，擴增效率嚴重不足（泳道1～3）。當濃度在0.15～0.375 mmol/L范圍內時，擴增條帶多且主帶清晰；濃度等于0.5 mmol/L，擴增條帶減少（泳道8）。之后沒有擴增產物。這可能是dNTPs濃度過高，影響了鎂離子與TaqDNA聚合酶的結合效率。這與鄭道君等[13]、歐虹雅等[16]的研究結果一致。可見，0.15～0.375 mmol/L范圍為正交試驗設計的dNTPs適宜濃度范圍。

2.1.4TaqDNA聚合酶濃度對SRAP-PCR反應體系的影響

TaqDNA聚合酶的活性和用量對SRAP-PCR擴增產物質量的影響較大。由圖2可知，當TaqDNA聚合酶濃度低于1 U，PCR反應不完全，造成條帶模糊甚至沒有擴增產物；隨著酶用量的增加，擴增條帶逐漸增多并清晰，尤其是TaqDNA聚合酶濃度在3 U時效果最好；當高于5 U時，開始出現拖尾現象。因此，選擇TaqDNA聚合酶2～5 U范圍用于正交試驗設計。

圖2 dNTPs濃度和Taq酶濃度對SRAP-PCR反應體系的影響Fig.2 Effect of dNTPs concentration and Taq DNA polymerase on SRAP-PCR reaction system

2.2 正交試驗結果與分析

通過單因素實驗確定適宜的的DNA濃度，引物濃度，dNTPs濃度和TaqDNA酶用量，用于文昌錐SRAP-PCR L16正交試驗設計（表3）。從擴增的結果（圖3）看，不同濃度的因素組合對文昌錐SRAP-PCR影響顯著，有的擴增失敗，有的擴增效率低，條帶弱且少。

表3 SRAP-PCR正交試驗設計Table 3 SRAP-PCR orthogonal test design

圖3 不同正交試驗組合的擴增結果Fig.3 Amplification results of diffferent orthogonal test combinations

根據條帶的清晰度、豐富度和條帶的強弱對每個組合的擴增結果進行打分，16個組合的分數依次為3，7，6，5，1，13，14，11，1，1，16，12，6，10，1，9。組合11的分數最高，為最佳組合，其擴增條帶總數為23條，其中包括強條帶13條和弱條帶10條；組合5，9，10和15無產物。因此，組合11是文昌錐SRAP的最佳反應組合，即總體系為20 μL，DNA含量為20 ng，引物濃度為0.6 μmol/L，dNTPs濃度為0.15 mmol/L，TaqDNA聚合酶用量為4 U。

正交試驗統計分析結果表明（表4），DNA濃度，引物濃度，dNTPs濃度和TaqDNA聚合酶用量對文昌錐SRAP-PCR的擴增影響程度不同。極差R值反應了每個因素對PCR擴增的影響程度，R值越大，影響越顯著。DNA，引物，dNTPs和TaqDNA聚合酶的R值分別為4.5，8，8，6.5，因此這4個因素對文昌錐SRAP-PCR擴增結果影響大小為：引物=dNTPs＞Taq酶＞DNA。

表4 正交設計結果直觀分析Table 4 Visual analysis of orthogonal design results

2.3 有效引物篩選及穩定性檢驗

采用已優化的反應體系，以LFT-01為模板，對100對SRAP引物進行初選，最終獲得70對具有3條以上擴增產物的SRAP引物。以3份地理距離相差較遠的文昌錐資源（LFT-01、BC-02、BC-20）的基因組DNA為模板，對70對初選引物進行多態性引物復選，以多態性百分率為主要標準（表5），獲得45對SRAP引物，擴增結果如圖4。這45對引物，多態性百分率在50%～87%，其中Me4-Em5多態性最好。從圖4的擴增效果看，基于最佳反應體系，45對引物在3份文昌錐資源上的擴增效果均較好，擴增條帶清晰，主帶型穩定，表明該體系穩定可靠，可以應用于文昌錐SRAP分析。

表5 經過復選后獲得的45對SRAP引物組合擴增信息分析及最佳退火溫度Table 5 Amplification information analysis and optimal annealing temperature of 45 pairs of SRAP primer combinations obtained after re-selection

圖4 經過復選后獲得的45對SRAP引物組合擴增結果Fig.4 Amplification results of 45 pairs of SRAP primers obtained after re-selection

3 結論與討論

PCR反應體系因植物材料的不同產生結果不同，DNA，引物，dNTPs、TaqDNA聚合酶均會對擴增結果產生影響。單因素試驗是保持其他影響因素不變的情況下，改變單一因素，忽視了各因子之間的相互影響[17]。而正交試驗不僅簡單高效，還考慮了各個因素之間的相互作用，已被廣泛應用于PCR體系優化[18-19]。本研究在分析明確DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶4個因子的單因素影響的基礎上，選擇適宜的濃度范圍用于正交試驗設計，為分析因素間的互交作用和確立最佳反應體系組合奠定基礎。單因素試驗結果表明，文昌錐的DNA濃度過高會嚴重阻礙到SRAP-PCR的擴增效率，這與海南龍血樹（Dracaena cambodiana）[12]、鷓鴣茶（Mallotus furetianus）[19]、朱頂紅（Hippeastrum rutilum）[20]和紅楓（Acer palmatum）[21]等物種隨著DNA濃度提高對PCR擴增效率影響不大，可能是文昌錐葉片細胞內含有TaqDNA聚合酶反應效率的抑制性物質較多引起，在以后的文昌錐PCR試驗中要引起重視。

正交試驗的直觀分析表明，在適宜的濃度范圍內，對文昌錐SRAP-PCR影響最大的因子是引物和dNTPs，R值為8；影響最小的因子為DNA。這與在葛根（Puerariasp.）[22]和鷓鴣茶（Mallotus oblongifolius）[23]中的研究結果基本一致。劉燕等[15]在海雀稗（Paspalum vaginatum）SRAP-PCR的優化體系試驗中發現dNTPs最大的影響因子，最小的影響因子為Taq酶；李培等[24]對紅椿（Toona ciliata）進行SRAP體系優化時，影響最小的因子是DNA濃度，但影響最大的因子是TaqDNA聚合酶的濃度。由此可知，不同植物的SRAP-PCR中，不同因素的影響程度也不盡相同，這可能是由于不同的植物DNA特性，以及Taq酶的活力不同造成的。

本研究通過單因素和正交試驗分析，率先獲得文昌錐SRAP-PCR最優體系：在20 μL的總體系中，DNA含量為20 ng，引物濃度為0.6 μmol/L，dNTPs濃度為0.15 mmol/L，Taq DNA聚合酶的含量4 U。基于該反應體系，從100對引物中篩選出45對能擴增出條帶清晰、多態性好的引物組合。經驗證，該反應體系具有較好的穩定性，為SRAP分子標記技術應用于文昌錐，及其他殼斗科錐屬植物資源研究打下良好的基礎。