子宮內膜VEGF在月經周期的表達變化研究

李 華 錢睿亞 李 蓉

目前，我國不孕不育患病人數已經高達7000萬，育齡期夫婦的不孕不育發生率已升高至12%～15%[1]。正常血管生成在子宮內膜種植窗的開啟和維持以及胚胎植入和發育過程中起著非常重要的作用，它可以促進子宮內膜間質水腫及蛻膜化發生[2]。參與子宮內膜血管生成的細胞因子主要有血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)及血管生成素(angiogenin，ANG)。其中VEGF對子宮內膜血管生成起到關鍵作用，可極強地刺激血管內皮細胞增殖，同時也具有增加血管通透性的作用。子宮內膜VEGF在月經周期中的變化規律和調控機制至今尚未完全闡明。既往有通過研究哺乳動物子宮內膜標本和研究女性月經周期血清中VEGF的變化推測其在人子宮內膜的變化規律，但是結果存在爭議。本研究旨在探索人子宮內膜VEGF在整個月經周期的表達變化。

對象與方法

1.研究對象及納入排除標準：研究對象：收集2014年1月～2019年12月于首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科及北京大學第三醫院生殖醫學中心行子宮內膜活檢或宮腔鏡檢查的患者留取的子宮內膜標本。納入標準：(1)月經規律(22～34天)，因男方因素不孕、超聲監測有排卵。(2)檢查前3個月未使用激素治療。(3)取得患者知情同意。排除標準：(1)宮腔鏡下可見子宮內膜炎、子宮內膜息肉、宮腔粘連、子宮縱隔等。(2)病理結果回報子宮內膜炎、子宮內膜息肉、子宮內膜增殖癥等。(3)除外其他生殖系統疾病如多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥、子宮肌瘤等。(4)除外內科合并癥。

2.標本收集及處理：對因B超提示子宮內異常(如子宮內膜回聲不均、宮腔積液、子宮內膜息肉等)為宮腔鏡手術探查指征的患者，在行宮腔鏡檢查未探及宮腔異常后，使用一次性子宮內膜吸管行子宮內膜活檢；對無宮腔鏡探查指征但需行子宮內膜活檢的患者直接采用一次性子宮內膜吸管行內膜活檢。子宮內膜離體后立即用0.9%NaCl注射液沖洗干凈表面血液，一份放入10%甲醛溶液固定，常規送病理檢查；一份放入4%多聚甲醛溶液固定24h后用石蠟包埋，待行免疫組織化學染色；另一份置于5ml EP管中放于-80℃冰箱保存。宮腔鏡手術、子宮內膜活檢由固定兩位醫生完成。標本的收集、處理由另外1位醫生完成，以保證結果的可靠性。

3.分組情況：依據內膜活檢的月經周期時間收集月經期、增殖早期、增殖中期、增殖晚期的子宮內膜。對擬取分泌期子宮內膜的患者在行宮腔鏡或子宮內膜活檢的月經周期由固定兩位醫生行超聲下卵泡監測，確定有排卵。所有入組標本均請兩位病理科醫生共同閱片。依據子宮內膜活檢的月經周期時間、超聲監測排卵情況及顯微鏡下切片圖像特點，將子宮內膜分為7組，即組1(月經期)、組2(增殖早期)、組3(增殖中期)、組4(增殖晚期)、組5(分泌早期)、組6(分泌中期)和組7(分泌晚期)。

4.免疫組織化學染色及結果分析：將石蠟包埋組織做切片兩張，一張行免疫組織化學染色，另一張行HE染色。每張切片在顯微鏡相同放大倍數下(×40)觀察，采用佳能微成像系統在相同曝光時間、背景光源下隨機選取2個視野拍攝照片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統對圖片進行分析，測量每張切片的累積吸光度(A)值，對VEGF在子宮內膜整體表達進行分析。顯微鏡下著色顆粒為棕色定義為強陽性，黃色定義為陽性，淡黃色定義為弱陽性，未著色定義為陰性，對VEGF在子宮內膜腺體和間質的不同表達進行定性分析。

改革不斷前行，形式不斷變化，然而數學課堂始終應是思維主導的課堂．筆者從“直線與圓的位置關系”復習課中進一步體會到“為思維而教”的真正含義和做法，如鯁在喉不吐不快，特梳理成文，就教于同行．

增殖早期、增殖中期、分泌中期、分泌晚期子宮內膜VEGF mRNA表達相近。

為了協調區域發展中的不平衡以及推動跨區域合作，為其提供理論參考與支持，在實踐中政府部門必須要深化區域旅游合作，基于旅游資源構建區域，制定政策方針，充分發揮中心城市自身的輻射帶動作用，通過跨地區合作等方式，實現最大空間效應，構建利益共同體，推動城市旅游行業的協調發展。

VEGF是子宮內膜血管內皮細胞增殖、血管生成和毛細血管通透性增加的主要調節因子[3]。cDNA序列研究表明VEGF存在著5種異構體，分別是VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206[4]。子宮內膜中VEGF來源于腺上皮細胞、間質細胞和血管內皮細胞[5]。此外，內膜組織中的巨噬細胞、間質中一些侵入的炎性細胞，如中性粒細胞、自然殺傷細胞也可以分泌VEGF[6]。VEGF有兩種主要受體，分別是VEGFR1和VEGFR2，主要分布于血管內皮及腺上皮細胞[4]。女性月經周期中子宮內膜VEGF的表達調控機制目前尚未完全闡明，大部分研究顯示其主要受缺氧和卵巢分泌的甾體激素調控。月經期內膜剝脫造成的缺氧刺激內膜間質細胞產生VEGF。在增殖期，逐漸升高的雌二醇(estrodiol，E2)作用于內膜間質及上皮細胞的雌激素受體，誘導VEGF的分泌進一步增加。進入分泌期，孕激素(progesterone，P)通過抑制雌激素受體，減輕雌激素對VEGF的作用[4]。此外，子宮內膜微環境中的一些細胞因子，如FGF、EGF等也可以通過自分泌和旁分泌的方式對VEGF的表達產生影響[5,6]。

1.入組情況：研究共入組113個標本，其中月經期標本20個，增殖早期15個，增殖中期16個，增殖晚期17個，分泌早期15個，分泌中期14個，分泌晚期16個。患者年齡為23～38歲，月經周期24～34天，各組平均年齡、月經周期比較，差異無統計學意義，詳見表1。

結 果

3.子宮內膜VEGF mRNA相對表達量：不同分組子宮內膜VEGF mRNA相對表達量詳見圖2。增殖晚期子宮內膜VEGF mRNA表達顯著增加，與各組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而月經期及分泌早期子宮內膜VEGF mRNA表達顯著減少(P<0.05)。

表1 不同組間子宮內膜A值及平均年齡、月經周期

2.圖像分析結果：月經期子宮內膜VEGF表達最低，增殖早期、增殖中期表達增強，至增殖晚期表達最強，與其他各個時期的表達比較，差異有統計學意義(P=0.001)。分泌早期開始，VEGF的表達下降，較增殖晚期下降顯著，差異有統計學意義(P=0.001)。到分泌中、晚期，VEGF表達再次升高。在月經周期中，月經期及分泌早期子宮內膜VEGF表達最低(P<0.05)，增殖晚期VEGF表達最大(P<0.05)，詳見表1、圖1。

圖1 不同組間子宮內膜A值組4與各組比較，*P<0.05；組1與組5比較，P=0.10；組1和組5與其余各組比較，P<0.05

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圖2 不同組間子宮內膜VEGF mRNA相對表達量增殖晚期與各組比較，*P<0.05；月經期、分泌早期與其余各組比較，*P<0.05

5.RT-PCR技術分析子宮內膜VEGF mRNA表達：-80℃冰箱中取出子宮內膜組織，復溶后充分研磨，TRIzol法提取組織總RNA。取2μl總RNA利用紫外分光光度計檢測RNA濃度及質量，合格樣本按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，后進行擴增、檢測，計算相對表達量。VEGF以GAPDH為內參基因，在Genbank上查找目的基因mRNA序列，經計算機引物設計網站設計引物，由上海生物工程有限公司合成兩對引物：GAPDH引物上游序列：5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，下游序列：5′-GGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′，目的片段長度為112bp；VEGF引物上游序列：5′-GAGGGCAGAATCATCACG-3′，下游序列： 5′-TCCAGGGCATTAGACACC-3′，目的基因片段長度為432bp。VEGF的擴增條件為：94℃變性30s，56℃退火30s,72℃延伸1min，30個循環。

4.免疫組化結果：顯微鏡下可以觀察到VEGF表達于子宮內膜腺體上皮細胞、間質及血管內皮細胞，表達定位于細胞質。VEGF在整個月經周期中都有表達，但是表達強度在各個時期有所不同：在月經期VEGF的表達呈弱陽性；進入增殖期后，內膜及間質都有強陽性的染色，增殖晚期著色明顯較深；分泌早期染色減弱，以弱陽性染色為主，分泌中、晚期又開始出現強陽性。此外，VEGF在同一時期的內膜腺體與間質表達也略有差異：在月經期VEGF主要表達于間質細胞；在增殖期及分泌早期，同一切片的子宮內膜腺體染色較間質深；在分泌中、晚期，間質染色較腺體深。對于內膜腺體來說，整個增殖其及分泌早期為強陽性染色，分泌中期及晚期為弱陽性染色。對于內膜間質來說，月經期為弱陽性染色，增殖早、中期為陽性染色，增殖晚期為強陽性染色，分泌早期為陽性染色，分泌中、晚期為強陽性染色(圖3)。

圖3 月經不同時期VEGF的表達(HE染色，×100)g.腺體；s.間質；b.血管；A.VEGF表達于子宮內膜腺體、間質、血管上皮細胞；B.月經期(M2)內膜，VEGF在間質染色弱陽性；C.增生早期(M6)子宮內膜，VEGF染色加深，部分腺體染色強陽性；D.增生中期(M10)子宮內膜，部分腺體染色強陽性，腺體染色較間質深；E.增殖晚期(M15)子宮內膜：腺體及間質染色均有強陽性染色；F.分泌早期(M16)子宮內膜：VEGF表達開始降低；G.分泌中期子宮內膜(M22)：染色加強，VEGF在間質表達較腺體強；H.分泌晚期(M27)子宮內膜：間質染色增強

討 論

6.主要試劑：VEGF為兔抗人1∶200，二抗為二步法通用山羊抗兔抗體，顯色劑為DAB，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。TRIzol試劑及反轉錄試劑盒購自美國Gibco/BRL公司。DNA聚合酶、內參GAPDH及VEGF引物購自上海生物工程有限公司。

本研究結果顯示，增殖期子宮內膜VEGF表達增加，到增殖晚期達到最大，這和月經周期中的E2水平變化一致。分泌早期開始后VEGF表達顯著下降，可能與下降的E2水平有關。但在分泌期中期，VEGF表達再次升高，特別是內膜間質VEGF表達增強，這說明在此時期，VEGF的表達不只受E2、P的影響，其他因素如內膜間質中增加的細胞因子的調控可能也發揮了重要作用。

我國氣電裝機以5大發電集團為主，其氣電發電量占全國的50%，其中華電集團、華能集團氣電裝機規模較大，2017年分別達到1432萬千瓦和1042萬千瓦。中國海油依托上游天然氣產業的優勢，開發建設了較多氣電項目，裝機總量達到846萬千瓦。另外，京能、深能源、浙能和粵電等地方發電企業的氣電裝機總量也分別達到478、318、236和234萬千瓦。國電、神華合并后，氣電裝機總量達到199萬千瓦（見圖3）。

關于子宮內膜VEGF的月經周期表達變化規律，既往研究結果存在很大爭議，但是結果都顯示其表達呈周期性變化。有研究將獼猴的子宮內膜作為研究對象，結果顯示子宮內膜間質VEGF在增殖中期達到高峰，內膜腺體VEGF在分泌晚期表達最強[7]。Licht等[8]研究了54例不孕女性分泌期的子宮內膜，發現分泌晚期子宮內膜VEGF表達最大，VEGF與子宮蛻膜化發生密切相關。另有研究53例健康女性不同時期血清VEGF水平，發現其在排卵前達到高峰，此后略有下降，但分泌期仍維持在較高水平，這與本研究結果相似[9]。在月經周期中，增殖期是子宮內膜血管最密集的生成階段，本研究結果也提示增殖晚期子宮內膜VEGF表達達到最大。增殖期VEGF表達的逐漸增加促進了子宮內膜血管的生成，從而促進子宮內膜的恢復、生長和向分泌期轉化，為隨后種植窗期胚胎的植入和發育提供必備條件。

子宮內膜容受性(endometrial receptivity，ER)是指子宮內膜接納胚胎植入的一種綜合狀態，包括子宮內膜豐富的血供和子宮內膜腔上皮、腺上皮及間質的充分發育，它開啟的時間是短暫的，僅在分泌中期的一小段時間[10]。ER的出現是諸多因素共同調控的結果，至今尚未完全闡明。在胚胎植入過程中，血管生成起到重要作用，因此，作為子宮內膜血管周期性生成過程中的關鍵調節因子，VEGF在ER調控過程中的作用也越來越被重視。近期研究表明，早期妊娠丟失和胚胎種植失敗與子宮內膜VEGF表達下降有關。馮苗等[11]研究對比了IVF-ET失敗患者和正常已育女性種植窗期的子宮內膜微血管密度與VEGF之間的差異，發現前者其內膜微血管密度與VEGF表達均低于正常女性，提示著床窗期內膜血管生成不良,可能是導致著床失敗的原因之一。Sadekova等[12]研究對比了復發性流產及正常已育女性分泌期子宮內膜VEGF的表達，結果顯示復發性流產患者子宮內膜VEGF較正常女性顯著降低，且兩組中黃體功能不全的患者其子宮內膜VEGF的表達更進一步降低，提示子宮內膜血管生成異常，可能是黃體期子宮內膜發育不成熟從而導致胚胎植入失敗的原因。

本研究結果顯示，月經期子宮內膜VEGF表達較低，進入增殖期后VEGF表達開始增強，增殖晚期達到高峰。增殖早、中期的VEGF通過促進血管內皮細胞增殖及血管形成，促進月經過后子宮內膜的修復和增殖。增殖晚期較高的VEGF水平，有利于其作用于內皮下的血管網，引起微血管進一步增殖和通透性增加，促進血漿自微血管流入到細胞間質，為隨后ER的出現提供條件[13]。進入分泌期，VEGF在短暫下降后在中、晚期的表達再次上升，維持在較高水平，且內膜間質VEGF的表達呈強陽性，提示VEGF可能在此時與子宮內膜微環境中的細胞因子互相作用，進而參與ER的構建，對胚胎的植入及內膜蛻膜化的發生產生影響[14]。

審計訴訟是會計師事務所面臨的巨大威脅，一旦出現審計訴訟，事務所的客戶就會流失，聲譽受損。所以為了減少審計訴訟的可能性，事務所就會想盡一切辦法地提高審計質量。

近年來輔助生育技術在不斷發展，但其臨床妊娠率與持續妊娠率都分別只有44%和41%[15，16]。雌孕激素與局部細胞因子對VEGF的調控與子宮內膜容受性的出現及胚胎的植入密切相關，這為在臨床治療中，尋找評估及改善子宮內膜容受性、提高妊娠率的方法提供了新思路。既往研究多關注子宮內膜厚度和分型與ER的關系，近年來多項研究認為子宮內膜血流也與ER密切相關。子宮內膜血流豐富者，其胚胎種植率及臨床妊娠率高，用彩色超聲多普勒能量圖記錄子宮內膜血流可以更好地評估子宮內膜容受性，對體外受精胚胎移植妊娠結局有更好的預測作用[17]。Yu等[18]研究顯示，使用外周血單核細胞進行宮腔灌注治療后可提高著床障礙小鼠子宮內膜VEGF的表達，改善子宮內膜容受性。此外，通過使用芬嗎通、低分子肝素、低劑量阿司匹林和西地那非等方法，也可以增加子宮內膜血流、提高臨床妊娠率[19]。

綜上所述，子宮內膜VEGF在月經周期呈周期性變化，增殖晚期表達最強，月經期及分泌早期表達最低，增殖早、中期及分泌物中、晚期處于較高水平。未來需進一步探索VEGF表達的調控因素，為探索評估子宮內膜容受性新指標及提高不孕癥患者臨床妊娠率的方法提供新思路。