苦參素對缺氧/復(fù)氧損傷乳鼠心肌細胞線粒體保護作用的研究

楊 超

線粒體是細胞有氧呼吸和能量轉(zhuǎn)化的主要場所，主要由雙層生物膜和嵴構(gòu)成。缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)茏瑁率够钚匝?reactive oxygen species，ROS)大量產(chǎn)生與過剩而引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，是各類缺血性心血管疾病共同的病理通路[1,2]。因此，保護線粒體對改善缺血性心血管疾病具有重要意義。苦參素(oxymatrine，OMT)又名氧化苦參堿，是中藥苦參的主要活性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于喹諾西啶類生物堿，具有良好的抗氧化活性[3]。目前臨床上主要用于慢性乙型病毒性肝炎及腫瘤放化療引起的白細胞減少癥的治療，近年來研究發(fā)現(xiàn)OMT對缺血性腦損傷后神經(jīng)元線粒體具有保護作用[4]。本研究將通過建立體外H/R損傷乳鼠心肌細胞模型，探究OMT對H/R所致乳鼠心肌細胞線粒體損傷的保護作用及其可能的機制。

材料與方法

1.實驗動物：SPF級SD大鼠乳鼠(<24h)，購自河北省實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(冀)2018-004。

2.藥物與試劑：OMT(純度≥98%)購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(批號：20190331)；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen 公司；二甲基亞砜(DMSO)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；NADH脫氫酶(ND)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、細胞色素氧化酶(CCO)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和ATP檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；膜電位(△ψm)、膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放度檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司。

3.乳鼠心肌細胞分離與體外培養(yǎng)：參照李雪麗等[5]報道的方法，無菌操作臺取乳鼠心臟心室組織，剪碎后加濃度0.625g/L胰酶和濃度0.05g/L的Ⅱ型膠原酶后恒溫37℃消化，細胞懸液過200目篩，1500r/min離心10min取沉淀，以DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)重懸后，經(jīng)37℃、5%CO2壁立1h，收集未貼壁細胞并調(diào)整細胞濃度為6×105個/毫升，接種于35mm培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2、100%濕度細胞培養(yǎng)箱中72h后，細胞呈同步搏動，用于實驗。

4.乳鼠心肌細胞分組、給藥與H/R損傷細胞模型制備：取對數(shù)生長期乳鼠心肌細胞，消化、重懸后調(diào)整細胞濃度為6×105個/毫升，設(shè)正常組、H/R組和OMT低、中、高劑量(20、40、80μg/ml)組，每組設(shè)10皿；造模前30min給藥干預(yù)[6]。除正常組外，其余各組棄培養(yǎng)液并用無糖DMEM沖洗3遍，2毫升/皿加入無糖DMEM培養(yǎng)基(預(yù)充95%N2和5%CO2混合氣15min)，置缺氧盒(通入95%N2和5%CO2混合氣，流速1L/min)，15min后將缺氧盒置細胞培養(yǎng)箱2.5h為缺氧過程，然后取出培養(yǎng)皿棄上清液，2毫升/皿加入含糖DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2、100%濕度細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即復(fù)氧。復(fù)氧2h后行各指標(biāo)檢測。

5.線粒體提取：復(fù)氧2h后，取各組細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，4℃、650×g離心力離心5min收集細胞，加入4℃預(yù)冷裂解液于冰上裂解30min后，4℃、650×g離心力離心20min取上清液，然后4℃、7700×g離心20min取沉淀，即為線粒體，通過Lowry法檢測蛋白濃度。

6.線粒體生化指標(biāo)檢測含量檢測：取1mg蛋白量線粒體，參照試劑盒操作說明進行處理后，采用比色法，通過紫外-可見分光光度計檢測線粒體ND、SDH、CCO活性和ATP含量。參照試劑盒操作說明進行處理后，通過紫外-可見分光光度計檢測線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力；通過原子化學(xué)發(fā)光法檢測游離Ca2+濃度。參照試劑盒操作說明進行處理后，遵照△ψm和MPTP開放度檢測試劑盒說明，通過熒光酶標(biāo)儀檢測△ψm水平(激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長590nm)和MPTP開放度(激發(fā)波長540nm，發(fā)射波長580nm)。

7.線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察：復(fù)氧2h后，取各組細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化、無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌3次后離心取細胞，置2.5%戊二醛固定2h、1%四氧化鋨固定15min后梯度乙醇脫水、丙酮沖洗、環(huán)氧樹脂包埋后行60nm超薄切片，醋酸鈉染色、檸檬酸鉛染色并晾干后，通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。

8.線粒體MDA含量和SOD、CAT活力檢測：經(jīng)4℃、超聲波破碎線粒體后，遵照試劑盒操作說明，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，黃嘌呤氧化法、鉬酸銨法分別檢測SOD、CAT活力。

結(jié) 果

1.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體呼吸酶活性和ATP含量的影響：與正常對照組比較，H/R組乳鼠心肌細胞線粒體ND、SDH、CCO活性和ATP含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H/R組比較，OMT中、高劑量組ND、SDH、CCO活性和ATP含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體呼吸酶活性和ATP含量的影響

2.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力和Ca2+濃度的影響：與正常對照組比較，H/R組乳鼠心肌細胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力顯著降低，游離Ca2+濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H/R組比較，OMT中、高劑量組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力顯著升高且游離Ca2+濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力和游離Ca2+濃度的影響

3.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體△ψm和MPTP開放度的影響：與正常對照組比較，H/R組乳鼠心肌細胞線粒體△ψm顯著降低、MPTP開放度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H/R組比較，OMT中、高劑量組△ψm顯著升高且MPTP開放度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表3。

表3 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體△ψm和MPTP開放度的影響

4.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響：TEM下可見，正常對照組乳鼠心肌細胞線粒體形態(tài)和線粒體膜、線粒體嵴等均未見異常；H/R組可見線粒體數(shù)量減少、膜腫脹破裂、膜磷脂層破壞、線粒體嵴溶解斷裂等超微結(jié)構(gòu)病變；與H/R組比較，OMT處理組線粒體膜、嵴超微結(jié)構(gòu)病變明顯改善，其中OMT高劑量組線粒體膜、嵴結(jié)構(gòu)較為完整，優(yōu)于其他組，詳見圖1。

圖1 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響(TEM，×10000)A.正常對照組；B.H/R組；C.OMT低劑量組；D.OMT中劑量組；E.OMT高劑量組

5.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體MDA含量和SOD、CAT活力的影響：與正常對照組比較，H/R組乳鼠心肌細胞線粒體MDA含量顯著升高，SOD、CAT活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H/R組比較，OMT中、高劑量組MDA含量顯著降低，SOD、CAT活力顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表4。

表4 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細胞線粒體MDA含量和SOD、CAT活力的影響

討 論

隨著高血壓、高血脂、高血糖等基礎(chǔ)疾病患病人群的增加，心肌梗死發(fā)生率呈逐年上升趨勢，及時疏通血管、恢復(fù)血氧供應(yīng)是臨床搶救心肌梗死患者的關(guān)鍵，但恢復(fù)氧供后ROS大量釋放導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，是引發(fā)二次損傷并嚴重影響預(yù)后的重要因素[7]。線粒體是心肌細胞最重要的細胞器，缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致其電子傳遞鏈?zhǔn)茏枋荝OS生成的主要原因，并且ROS將攻擊破壞線粒體膜和嵴結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體內(nèi)細胞色素C釋放并誘導(dǎo)細胞凋亡與自噬，從而加重病情[8]。因此保護線粒體對改善缺血性心血管疾病預(yù)后至關(guān)重要。

有氧呼吸是實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)換、產(chǎn)生ATP并為機體供給能量的主要途徑，而線粒體是實現(xiàn)該過程的場所。有氧呼吸過程依賴于線粒體內(nèi)呼吸酶(ND、SDH、CCO)的催化作用。生理狀態(tài)下，體內(nèi)ROS生成與代謝清除維持動態(tài)平衡，但缺氧/復(fù)氧將病理性刺激ROS大量釋放致使抗氧化酶(SOD、CAT)被過度消耗，不能及時代謝清除的ROS將攻擊破壞核酸、蛋白質(zhì)等大分子，攻擊生物膜不飽和脂肪酸生成具有生物毒性的MDA[9，10]。正常的線粒體△ψm水平對維持線粒體功能至關(guān)重要，Alizadeh等[11]研究發(fā)現(xiàn)△ψm降低將直接影響ATP合成。MPTP開放度病理性升高將破壞離子平衡，導(dǎo)致ROS生成、△ψm下降、細胞色素C釋放，加重線粒體損傷[12]。

本研究通過分離并體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，制備H/R損傷心肌細胞模型，發(fā)現(xiàn)模型細胞線粒體呈現(xiàn)數(shù)量減少、膜腫脹破裂、膜磷脂層破壞、線粒體嵴溶解斷裂等超微結(jié)構(gòu)病變，該結(jié)果與陳克芳等[13]研究報道一致；造模前30min給予OMT進行干預(yù)，能夠明顯提高線粒體ND、SDH、CCO活性和ATP含量，降低MDA含量并提高SOD、CAT活力，明顯改善線粒體超微結(jié)構(gòu)病變，提高線粒體△ψm并降低MPTP開放度，提示OMT對H/R所致乳鼠心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷具有保護作用，可能與抑制氧化應(yīng)激和維持線粒體膜穩(wěn)定性有關(guān)。

線粒體具有儲存Ca2+并維持細胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡的作用，線粒體的吸收和釋放依賴Na+-Ca2+交換和Ca2+-ATP酶。ATP酶活力具有ATP依賴性，當(dāng)線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損導(dǎo)致ATP合成受阻時將直接導(dǎo)致ATP酶活力降低。Ca2+-ATP酶活力降低將導(dǎo)致Ca2+泵出功能障礙，而Na+-K+-ATP酶活力降低將引發(fā)Na+-Ca2+交換使Ca2+大量進入線粒體，從而引發(fā)線粒體Ca2+超載[14]。過量的Ca2+能夠破壞線粒體氧化磷酸化過程使ATP合成受阻，進一步抑制ATP酶活性，從而形成“ATP合成受阻-Ca2+超載”的惡性循環(huán)，加重心肌組織損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模前30min給予OMT進行干預(yù)，能夠明顯提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力并降低游離Ca2+濃度，提示抑制Ca2+超載可能是OMT保護H/R所致乳鼠心肌細胞線粒體損傷的重要機制之一。

綜上所述，OMT對H/R所致乳鼠心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷具有一定的保護作用，作用機制可能與抑制線粒體Ca2+超載、抑制氧化應(yīng)激和維持膜穩(wěn)定性有關(guān)。