兩種造模方法致大鼠慢性腎病模型的腎功能及病理變化比較

李天祎 楊 揚 楊素萍 李嘉琦 馬逸群 王家平

慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)是影響全球公共健康的主要疾病之一，全球發生率約為8%～16%[1]。臨床多表現為蛋白尿、低蛋白血癥、水腫以及高脂血癥等。因CKD發生率逐漸增高，病程遷延，很難治愈，末期多發展為慢性腎衰竭，只能依靠透析、換腎等僅有的治療方式緩解，已經逐漸成為威脅人類健康的一類慢性疾病。隨著人們對慢性腎病發病機制和病理變化等研究的深入，建立慢性腎病動物模型對研究CKD的腎組織病理形態學變化以及探究治療CKD的新方法有著重要的意義。

目前，國內外公認的模擬慢性腎病效果較好的為阿霉素(adriamycin，ADR)大鼠模型。ADR在大鼠體內代謝較為緩慢，對心臟、肝臟、骨髓、胃腸等具有較強的不良反應，但經尾靜脈注射后，其毒性可主要積累于腎臟[2]。因此，應用ADR造模時，應注意注射的方式、劑量等。近年來，應用較為廣泛的方法主要有尾靜脈注射法(單次或多次)、單側腎切除+重復尾靜脈注射ADR和腎動脈注射法等。本研究比較單側腎切除+重復尾靜脈注射ADR及二次尾靜脈注射ADR這兩種方法，旨在為更好地復制慢性腎病模型提供更加豐富的參考依據。

材料與方法

1.實驗材料：(1)實驗動物：雄性SD大鼠，18只，體質量150～200g，購自昆明醫科大學實驗動物中心，保證動物在室溫下正常飼養。(2)主要試劑：阿霉素(ADR)購自美國Sigma公司，醫用縫線、一次性無菌巾、75%乙醇、醫用紗布等購自杭州華威醫療用品。

2.實驗方法：(1)大鼠造模：將18只SD大鼠隨機分為3組，即N組、A組和B組。N組為正常對照組(n=6)。A組為單側腎臟切除+重復尾靜脈注射ADR(n=6)，將大鼠10%水合氯醛麻醉后，取俯臥位固定于超凈臺，選取左側肋嵴角為手術切口，逐層剝離皮膚、皮下脂肪及肌肉組織后，將左側腎蒂剝離，用手術縫線進行結扎，切除腎臟，縫合手術切口后消毒，術后以3mg/kg阿霉素經大鼠尾靜脈注射，將大鼠歸籠正常飼養，并于14天后再次尾靜脈注射ADR(3mg/kg)1次。B組以3mg/kg ADR分兩次經尾靜脈注射(n=6)，兩次間隔14天注射。

3.觀察指標：(1)一般情況：觀察各組大鼠的精神狀態、毛色、體質量變化等一般情況，有無水腫，腹腔積液或癱瘓等。(2)大鼠腎功能檢測：注射后第4、8、12周，將大鼠用乙醚麻醉后采用內眥采血法，3000r/min離心20min，分離血清。日本日立7170A型全自動生化分析儀檢測血尿素氮、血肌酐、血清白蛋白，各組標本均在筆者醫院檢驗科完成。(3)腎組織病理形態學觀察：于第12周末處死各組大鼠，取出右腎，快速剝離腎包膜，放置在10%甲醛溶液中固定，脫水、透明、石蠟包埋后，切片(厚約3μm)，作蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察并攝片。

4.統計學方法：采用IBM SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.一般情況：N組大鼠活動靈便，狀態良好，毛色順滑。A、B組兩組大鼠狀態較差，部分大鼠伴有毛發脫落，活躍欠佳，飲食量有不同程度減少，均出現不同程度水腫，毛色黯淡、微黃，精神不振，部分大鼠伴有腹腔積液，其中A組比B組變化更為明顯。

2.各組腎功能變化：與N組比較，A、B兩組大鼠血肌酐、血尿素氮升高，并表現為低蛋白血癥。血尿素氮(BUN)值：8、12周末，A組尿素氮即出現上升(P<0.05)，B組在12周末尿素氮上升較為明顯(P<0.05)；血肌酐(Cr)值：A、B組血肌酐在8周末及12周末較4周時均有明顯上升(P<0.05)；白蛋白值：A、B組較N組均有降低，在8周時A組下降較為明顯(P<0.05，表1，圖1)。

表1 各組大鼠腎功能及白蛋白比較

圖1 各組大鼠腎功能及白蛋白比較與A組比較，*P<0.05

3.腎組織病理學改變：肉眼觀察：12周末A組腎臟體積明顯增大，表面凹凸不平，呈彌漫性顆粒狀改變，色澤呈黃褐色改變；B組腎臟包膜緊張，表面尚光滑，色偏黃褐。光鏡下觀察：N組大鼠的腎小球、腎小管和腎間質未見明顯異常改變；A組腎臟的腎小球出現萎縮，硬化，局部腎小球毛細血管袢擴張淤血，腎小管結構紊亂，上皮細胞可見空泡樣變性，腔內可見蛋白管型，并且腎間質內大量炎性細胞浸潤，受損程度和灶性病變范圍較B組加重；B組大鼠的腎組織切片顯示，腎臟近曲、遠曲小管、髓袢和集合管上皮可見不同程度水腫變性，部分管腔擴張，腔內可見少量透明管型，部分腎小球有輕微的萎縮，腎間質內可見少量輕-中度淋巴細胞和漿細胞浸潤的炎性反應(圖2)。

圖2 各組大鼠腎組織HE染色結果(×20)A.N組；B.A組；C.B組

討 論

阿霉素(ADR)，又名多柔比星，做為一種蒽環類抗生素，在臨床中廣泛應用于多種癌癥的治療[3]。其導致腎臟損傷的發病機制主要有3個方面：①ADR抑制大鼠腎臟的自噬過程，造成肌動蛋白細胞骨架損傷，足細胞足突消失[4]；②ADR可以誘導腎小球上皮細胞過氧化反應，造成腎小球濾過膜完整性被破壞，導致濾過屏障受損而形成持續蛋白尿；③ADR能激活多種炎性介質，促進系膜細胞增殖，隨著病程遷延逐漸發展導致腎小球硬化[5]。全球首次報道阿霉素腎病在20世紀80年代初，近年來，在使用阿霉素造模過程中，對于用法與用量仍存在分歧和爭議。因較大劑量會使大鼠出現心力衰竭、免疫力下降甚至死亡，而減少劑量則使造模時間延長，大鼠腎臟損傷達不到造模標準，所以對于阿霉素的應用劑量和造模方法目前仍然無法統一[6]。

目前，較為常用的慢性腎病模型制作方法主要有以下5種：①5/6腎切除[7]；②尾靜脈注射阿霉素；③單側腎切除+尾靜脈注射阿霉素[8,9]；④尾靜脈注射環孢素；⑤結扎單側輸尿管等方法[10]。研究報道，尾靜脈注射ADR法，首次劑量過大易出現大鼠極度狂躁、死亡等情況，尾靜脈注射次數過多可能出現阿霉素外滲，造成劑量不足或大鼠尾部潰爛等情況發生[11]。單側結扎大鼠輸尿管的方法在制作模型時，因需要把腎盂輸尿管結合部和輸尿管膀胱入口處一并結扎，所以手術切口較大，并且找尋輸尿管所需時間較長，故造成的手術不良反應較大，且具有易感染等缺陷；5/6腎切除法對于術者要求較高，手術切面過大，出血量也隨之增大，病死率較高[12]。根據本實驗研究并對比上述造模方法，單側腎臟切除+二次尾靜脈注射ADR法具有以下優勢：①手術切口較小，可直接結扎單側腎蒂，出血量較小，手術時間縮短，可降低大鼠的感染概率，病死率較小；②單側腎臟切除后阿霉素給藥劑量較單次尾靜脈注射ADR法小，可降低阿霉素外滲可能，減輕大鼠尾部潰爛；③大鼠造模后，成模所需時間較二次尾靜脈注射ADR法更短，且成模效果較好。

本研究比較的兩種方法均可制作阿霉素腎病模型。單側腎臟切除+重復尾靜脈注射ADR和兩次尾靜脈注射ADR法均可使大鼠腎功能發生改變。在各個觀察點A、B兩組的血肌酐、血尿素氮值比較，差異均有統計學意義，與此同時，兩組的腎組織也具有顯著的形態學變化。其中A組血肌酐、血尿素氮在第8周時即出現上升，白蛋白也在8周末出現明顯下降，且A組大鼠腎臟病理切片顯示腎小球出現萎縮，硬化，球囊粘連，局部腎小球毛細血管袢擴張淤血，腎小管上皮細胞可見空泡樣變性，腔內可見蛋白管型，并且腎間質內可見大量淋巴細胞和漿細胞浸潤。這一結果提示單側腎切除+重復尾靜脈注射阿霉素法發展為慢性腎衰竭的趨勢更加明顯。產生這一結果的原因可能與單側腎臟的負荷加重導致代償功能不足，呈現出腎功能進行性加重，故而更加符合慢性腎衰竭的表現，其腎臟的病理學改變也證明了這一點[13]。

近年來，阿霉素大鼠模型因其能更好地復制人類慢性腎病表現而得到了廣泛的研究與應用，ADR可誘導腎小球內皮變薄和足細胞消失，這與血漿蛋白過濾的大小和電荷特異性屏障的喪失有關[14]。其動物模型的組織學變化與人類局灶性腎小球硬化相似，伴有足細胞融合、局灶節段性和腎小球硬化以及腎小管間質炎癥和纖維化，并且大鼠表現出來的血清肌酐升高、肌酐清除率降低、血清白蛋白降低、血脂異常和尿蛋白排泄增加，與腎病綜合征和CKD一致[15]。本研究的不足之處在于觀察時間僅到12周，無法觀察12周之后的腎功能變化趨勢，除此之外在應用阿霉素過程中，由于實驗大鼠的批次、藥物敏感度和遺傳變異等方面會對大鼠的腎功能產生一定的影響，因此如何使大鼠腎臟損傷趨于穩定還需進一步研究。