上調lncRNA CTA-246H3.12通過調節miR-515-5p抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲

常昆鵬 魏珍星 李 斐 張 煒

鼻咽癌是臨床較多見的惡性腫瘤之一，與EB病毒感染有關，男性的發生率是女性的2倍[1]。近年來，對鼻咽癌的診治手段有了顯著進步，然而鼻咽癌的易復發和易轉移導致部分患者的預后仍不理想[2]。早期發現、治療及監測復發、轉移對鼻咽癌患者的預后具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200nt的非編碼RNA分子，位于細胞核或胞質內，長期以來被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，并不具有生物學功能[3]。近年來研究表明，lncRNA參與基因組印記、轉錄激活、核內運輸等各種生理過程, 與鼻咽癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤的發生及發展密切相關[4～6]。CTA-246H3.12全長747nt，是一種新發現的lncRNA，但CTA-246H3.12在疾病方面特別是鼻咽癌的研究鮮有報道。本研究通過檢測鼻咽癌組織和細胞系中CTA-246H3.12的表達水平, 進一步分析上調CTA-246H3.12影響鼻咽癌細胞增殖和侵襲的分子機制。

材料與方法

1.組織標本、細胞系和主要試劑：收集2016年9月～2018年7月筆者醫院耳鼻喉科33例活檢切除鼻咽癌組織，其中男性18例，女性15例，患者年齡31～54歲，平均年齡47.28±7.26歲。按照鼻咽癌WHO 病理分型(2005)版進行分型，角化癌13例，非角化性癌20例。按照美國癌癥聯合委員會鼻咽癌TNM分期系統(2010年第7版)對鼻咽癌患者進行分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例。選取2017年8月～2018年5月33例慢性鼻咽炎患者的鼻咽黏膜組織作為對照。本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會批準，患者均簽署知情同意書，所有患者均未行術前放療和化療，所有標本經術后兩名以上病理科醫生確診。鼻咽癌細胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1) 和人永生化鼻咽上皮細胞(NP69)購自中國典型培養物保藏中心，RPMI 1640培養基、K-SFM培養基培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，qPCR試劑盒購自美國Roche公司，攜有無意義序列的陰性對照質粒和攜有CTA-246H3.12的質粒購自上海吉瑪制藥有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自美國Sigma公司，LipofectamineTM2000和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，抗體購自美國CST公司。

2.細胞培養和轉染：鼻咽癌細胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1)用RPMI 1640(含10%胎牛血清)培養基常規培養，人永生化鼻咽上皮細胞(NP69)用K-SFM(含10%胎牛血清)培養基常規培養，均培養于37℃、5%CO2培養箱，隔天傳代，取對數生長期細胞進行轉染。以對數生長期的C666-1細胞進行轉染，以攜有無意義序列的陰性對照質粒作為陰性對照組，以攜有CTA-246H3.12的質粒作為CTA-246H3.12組，根據LipofectamineTM2000說明書進行轉染操作，隔天換液。

3.qPCR檢測：使用Trizol法提取組織或細胞總RNA，反轉錄為cDNA后，根據qPCR試劑盒說明書進行操作。每個樣本設4個復孔，以GAPDH為內參檢測CTA-246H3.12和CDX1 mRNA的表達，以U6為內參檢測miR-515-5p的表達。反應條件為96℃ 10min、95℃ 10s、62℃ 40s、72℃ 40s，40個循環。以2-ΔΔCt法計算CTA-246H3.12、miR-515-5p和CDX1 mRNA的相對表達。qPCR引物如下：CTA-246H3.12上游引物：5′-CCCAATCACACAGACATTGC-3′，下游引物：5′-TGGGGACCTCATCAACATTT-3′；CDX1上游引物：5′-GGTGGCAGCGGTAAGACTC-3′，下游引物：5′-TGTAACGGCTGTAATGAAACTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-CTGTGGGAGCGAATCGAGG-3′，下游引物：5′-CAGCGCAAGATGTCCATCA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-515-5p上游引物：5′-GGGTTCTCCAAAAGAAAGCAC-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

4.MTT法：細胞轉染后48h，將兩組細胞分別以每孔2000個接種于96孔板，分別在第1、2、3、4、5天進行MTT法測量。每孔加入10μl MTT溶液，在孵箱內培養4h，除去孔內氣泡，采用酶標儀檢測450nm波長處的吸光度值，每組4個復孔。

5.Transwell侵襲實驗：將RPMI 1640培養基與Matrigel基質膠以1∶10的比例混合，每個小室上室加入100μl，置于培養箱中凝固。細胞轉染后48h，將兩組分別消化，用RPMI 1640培養基重懸并計數。在上室加入200μl細胞懸液(2×104個細胞)，在下室加入600μl完全培養基。培養箱培養24h，取出上室，固定、染色、計數。

6.生物信息學方法：根據LncBase Predicted v.2預測網站分析CTA-246H3.12的靶向miRNA，根據miRWalk2.0預測網站分析miRNA的靶向基因。

7.Western blot法檢測：細胞轉染后48h，將兩組細胞裂解并提取總蛋白，按50μg蛋白上樣進行10%聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉膜后使用5%脫脂奶粉封閉，分別與一抗在4℃下孵育過夜，與二抗孵育后，滴加化學發光試劑，采用凝膠成像系統掃描、拍照。

結 果

1.CTA-246H3.12在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中的表達：與慢性鼻咽炎組織比較，CTA-246H3.12在鼻咽癌組織中表達下調(P<0.01，圖1)。

圖1 CTA-246H3.12在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中的表達

2.CTA-246H3.12在正常鼻咽上皮細胞和鼻咽癌細胞系的表達：與人永生化鼻咽上皮細胞(NP69)比較，CTA-246H3.12在鼻咽癌細胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1)中表達下調(P<0.05)，C666-1細胞中CTA-246H3.12的表達量最低(P<0.01，圖2)。

圖2 CTA-246H3.12在人永生化鼻咽上皮細胞和鼻咽癌細胞系中的表達與NP69細胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.CTA-246H3.12質粒的轉染效率：陰性對照組和CTA-246H3.12組C666-1細胞中CTA-246H3.12相對表達量分別為1.07±0.22和11.43±0.96(P<0.01)，質粒轉染成功。

4.上調CTA-246H3.12對C666-1細胞增殖的影響：MTT檢測結果顯示，與陰性對照組比較，CTA-246H3.12組的C666-1細胞從第3天起，增殖能力降低(P<0.05，圖3)。

圖3 CTA-246H3.12對鼻咽癌細胞C666-1增殖的影響與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.上調CTA-246H3.12對C666-1細胞侵襲的影響：陰性對照組和CTA-246H3.12組C666-1細胞侵襲細胞計數分別為81.62±4.59和38.01±7.27(P<0.01，圖4)。與陰性對照組比較，轉染CTA-246H3.12后的鼻咽癌細胞侵襲能力被抑制。

圖4 CTA-246H3.12對鼻咽癌細胞C666-1侵襲的影響

6.生物信息學方法預測結果：如圖5所示，LncBase Predicted v.2預測網站分析CTA-246H3.12的靶向miRNA是miR-515-5p，miRWalk2.0預測網站分析miR-515-5p的靶向基因是CDX1。

圖5 生物信息學方法預測CTA-246H3.12的靶基因

7.兩組細胞中miR-515-5p、CDX1 mRNA的表達：陰性對照組和CTA-246H3.12組C666-1細胞中miR-515-5p相對表達量分別為1.02±0.12和0.25±0.03(t=6.45，P<0.01)。與陰性對照組比較，CTA-246H3.12組細胞中miR-515-5p的表達降低。陰性對照組和CTA-246H3.12組C666-1細胞中CDX1 mRNA相對表達量分別為1.07±0.22和7.04±0.81(t=7.08，P<0.01)。與陰性對照組比較，CTA-246H3.12組細胞中CDX1 mRNA的表達增加。

8.上調CTA-246H3.12對CDX1蛋白及下游蛋白表達的影響：Western blot法結果顯示，與陰性對照組比較，轉染CTA-246H3.12后，CDX1蛋白表達增加，細胞周期相關蛋白Cyclin H、CDK7蛋白的表達明顯降低，細胞侵襲相關蛋白Twist2、Slug的表達明顯降低(圖6)。

圖6 Western blot法檢測 CTA-246H3.12對CDX1蛋白表達的影響

討 論

尋找新的鼻咽癌生長和轉移的分子靶點，是臨床鼻咽癌的未來治療的方向[7]。越來越多的研究表明, 長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)可發揮表觀遺傳調控、轉錄水平調控及轉錄后水平調控的作用，參與疾病的發生和發展[8]。lncRNA對鼻咽癌細胞增殖和轉移行為的影響受到廣泛的關注[9]。lncRNA如THOR、HOTAIR、LINC00460、C22orf32-1、ANRIL等對鼻咽癌的增殖和轉移具有重要的調控作用，與鼻咽癌患者的預后相關，可能參與鼻咽癌的發生和發展[2, 4～6, 10]。CTA-246H3.12是一種新發現的lncRNA，其在疾病特別是鼻咽癌中的分子機制尚不明確。

本研究發現，CTA-246H3.12在鼻咽癌組織和細胞系中表達下調，表明CTA-246H3.12可能在鼻咽癌的發生和發展中發揮調控作用。MTT法和Transwell侵襲實驗顯示，上調CTA-246H3.12可抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲。近年來研究表明，lncRNA可作為競爭性內源RNA，特異性地與miRNA 結合，下調miRNA的活性，從而間接上調miRNA靶基因的表達[11, 12]。生物信息學方法顯示，CTA-246H3.12的靶基因可能是miR-515-5p，miR-515-5p的靶基因可能是尾側型同源盒轉錄因子1(CDX1)。CDX1屬于CDX家族的成員之一，最初被發現具有調控胚胎發育的作用，參與調控腸上皮細胞的分化和維持腸上皮結構[13]。近年來研究表明，CDX1在胃癌、乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤組織中表達缺失，與腫瘤的增殖、遷移和侵襲行為的獲得呈負相關[14, 15]。高表達CDX1可抑制腫瘤的生長和轉移，CDX1發揮抑癌基因的作用。本研究發現，上調CTA-246H3.12的C666-1細胞中miR-515-5p的表達降低，CDX1mRNA的表達增加，下調miR-515-5p的活性，從而間接上調miR-515-5p靶基因CDX1的表達。CDX1表達表達上調后，細胞周期相關蛋白Cyclin H、CDK7蛋白的表達明顯降低，細胞侵襲相關蛋白Twist2、Slug的表達明顯降低，表明鼻咽癌C666-1細胞的增殖和侵襲能力降低。

綜上所述，CTA-246H3.12在鼻咽癌組織和細胞系中表達降低，上調CTA-246H3.12可抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲，其分子機制可能是通過抑制miR-515-5p的表達，間接促進CDX1基因的表達。CTA-246H3.12在鼻咽癌的發展中可能發揮抑癌基因作用，為今后鼻咽癌的治療提供新的潛在治療靶點。