動物尿液中β-受體激動劑酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用通則的建立

趙立軍，姚順凱，張靜，林順全，馮波，李云

（1.四川省飼料工作總站，四川 成都 610041；2.四川省若爾蓋縣動植物產(chǎn)品檢驗檢疫站，四川 若爾蓋 624500）

β-受體激動劑又叫β-興奮劑，也稱“瘦肉精”，臨床上常被用作止喘藥，因其具有加快畜禽生長、降低動物脂肪含量、提高瘦肉率等作用，在養(yǎng)殖中往往被非法使用［1-3］。β-受體激動劑會在動物組織中形成蓄積性殘留，通過食物鏈進入人體，對人的肝、腎等內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒副作用，造成肌肉震顫、心悸、眩暈、惡心等癥狀［4-5］。早在2002 年我國就明確將鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、西馬特羅、特布他林等β-受體激動劑列為養(yǎng)殖環(huán)節(jié)禁用物質(zhì)。

為保證動物產(chǎn)品質(zhì)量安全，國家每年都將β-受體激動劑類物質(zhì)列為重點監(jiān)控對象。盡管如此，仍有一些不法養(yǎng)殖場戶受利益驅(qū)使，違法使用“瘦肉精”類物質(zhì)，導(dǎo)致有毒有害畜產(chǎn)品流向市場、進入百姓餐桌。因此，加強對動物尿液中β-受體激動劑類物質(zhì)的快速準(zhǔn)確檢測十分必要［6-7］。目前，國內(nèi)外關(guān)于動物尿液中β-受體激動劑類藥物多殘留分析一般采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［8-9］和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［10-11］等方法。該方法具有靈敏度高和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，但需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，檢測成本高，無法滿足基層檢測機構(gòu)對樣品進行批量和快速檢測的需要［12-13］。

近年來，酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)在國內(nèi)外農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中得到廣泛普及，其所用設(shè)備成本低、操作簡便、靈敏度高［14-15］。商品化酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的檢測速度快，可實現(xiàn)樣品的批量化檢測。目前國內(nèi)市場上針對動物尿液中β-受體激動劑的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒種類繁多，但產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。操作人員由于對產(chǎn)品性質(zhì)、使用方法、注意事項等關(guān)鍵環(huán)節(jié)理解的偏差，往往造成檢測結(jié)果不正確、假陽性率高，可能導(dǎo)致陽性樣品流入市場［16］。

本文建立了酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用通則，將有效指導(dǎo)檢驗檢測機構(gòu)采購和驗收該類產(chǎn)品，規(guī)范操作人員的關(guān)鍵控制點，從而保障基層農(nóng)產(chǎn)品樣品的批量檢測和準(zhǔn)確檢測。

1 術(shù)語與定義

下列術(shù)語和定義適用于本使用通則。

1.1 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 基于酶聯(lián)免疫技術(shù)研發(fā)的可用于檢測樣品中某種或某幾種化合物具體含量的產(chǎn)品，由多種化學(xué)或生物制品（如抗原、抗體、酶結(jié)合物、稀釋緩沖液等）組合而成。

1.2 靈敏度 試劑盒可從樣品中檢測出待測物的最低濃度，用檢測限來表示。

1.3 準(zhǔn)確度 測定值與真實值的接近程度，表示試劑盒分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，用添加回收率來表示。

1.4 精密度 在限定條件下，用某種分析方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品所得測定值的彼此接近程度，表示分析結(jié)果的重現(xiàn)性，用變異系數(shù)表示。

1.5 定量限 符合準(zhǔn)確度和精密度要求的試劑盒可定量檢測的濃度。

2 產(chǎn)品質(zhì)量要求

2.1 外觀要求 試劑盒外包裝應(yīng)潔凈、無破損；內(nèi)包裝應(yīng)無破損、無裂痕、無滲漏。標(biāo)簽清晰，包括品名、批號、保存條件、檢測限、有效期信息。盒內(nèi)各組分完整，與說明書描述一致。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 線性相關(guān)系數(shù)r≥0.99；拐點數(shù)≤2個。

2.3 靈敏度 靈敏度與說明書標(biāo)注的靈敏度一致。

2.4 準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度范圍在60%～120%。

2.5 精密度 批內(nèi)變異系數(shù)≤15%；批間變異系數(shù)≤20%。

3 使用方法

3.1 樣品處理 若待檢動物尿液澄清，則直接取樣品進行檢測；若尿液渾濁，需過濾或離心后取上清液進行檢測。

3.2 樣品檢測 取出所需酶標(biāo)板條和試劑置于平整的臺面上，放置至說明書要求的溫度，并按照說明書描述進行操作，同時做添加回收率實驗。

3.3 添加回收率實驗 將空白樣品添加為各β-受體激動劑定量限1 倍或2 倍的濃度，制備成陽性樣品。取兩份同一濃度樣品按說明書描述進行實驗操作。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算后，得出添加回收率，其相對偏差應(yīng)不大于15%。

3.4 結(jié)果分析

3.4.1 百分吸光度的計算 百分吸光度等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度平均值（雙孔）除以零標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度平均值，再乘以100%。

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.4.3 定量分析 將樣品百分吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算所對應(yīng)的β-受體激動劑濃度，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中β-受體激動劑藥物的實際濃度。實驗結(jié)果為陽性的樣品應(yīng)經(jīng)儀器確證方法進行確證。

4 注意事項

4.1 實驗開始前應(yīng)檢查試劑盒的保存條件和有效期，仔細閱讀產(chǎn)品說明書確認其適用范圍，并按要求準(zhǔn)備所需器材。檢查試劑盒內(nèi)、外包裝是否潔凈、完整，標(biāo)簽是否清晰，材料、試劑是否齊全。

4.2 尿液樣品應(yīng)收集在潔凈干燥、不含任何防腐劑的塑料杯或玻璃容器中，并及時檢測；若不能及時檢測，可在2～8 ℃下冷藏保存24 h，若需長期保存需置于-20 ℃以下冷凍，切忌反復(fù)凍融。

4.3 尿液樣品在檢測前需放置至試劑盒說明書要求的溫度。

4.4 實驗前應(yīng)將所有試劑和所需板條的溫度放置至說明書指定溫度，實驗環(huán)境應(yīng)配有溫控設(shè)施，避免陽光直射。

4.5 取出需要數(shù)量的板條，將剩余的板條按說明書要求存放。

4.6 實驗前須檢查各種實驗器具是否潔凈，避免污染。

4.7 每種試劑使用前均須搖勻，避免接觸皮膚。

4.8 實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同的試劑時應(yīng)更換吸頭。加液時應(yīng)避免吸頭觸碰板孔內(nèi)壁。

4.9 洗板過程中如出現(xiàn)板孔干燥，會造成標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈線性、重復(fù)性差。因此洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

4.10 部分產(chǎn)品恒溫孵育過程要求避光操作，應(yīng)將反應(yīng)板條置于暗處或用蓋板膜封住微孔板。

4.11 不得使用不同批號試劑盒中的試劑。

4.12 嚴格按說明書要求儲存試劑盒及未使用的試劑材料。