應用于羊肉脫膻的三種發酵劑篩選及發酵特性研究

彭健斌，蘇 平，林 雨，梁文康

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州 310058）

作為一種優良的畜肉，羊肉屬于高蛋白、氨基酸總類豐富、低脂肪、低膽固醇且易于消化吸收的營養保健食品[1]。研究表明，羊肉具有抗氧化、抗疲勞、抑制脂肪積累、降低心血管病發病率等多種保健作用[2]，因此深受人們喜愛。近年來，我國羊肉消費需求進一步擴大，呈現穩定增長趨勢[3]，但是羊肉所具有的特殊的膻味在一定程度上影響了羊肉的品質，降低人們對羊肉的可接受度，限制了羊肉的消費和開發。BRENNAND C P等[4]通過對羔羊脂肪組織和肌肉組織中揮發性脂肪酸（C4～C11）進行定量分析，結果證明，4-甲基辛酸和4-乙基辛酸對膻味起主要骨架作用。YOUNG O A等[5]的研究認為，羊的膻味與4-甲基辛酸和4-甲基壬酸有明確的聯系。

目前，國內外采取了各種方法來減少或除去膻味，主要有漂洗法[6]、食藥材法[7]、擠壓法[8]、包埋法[9]和微生物發酵法[10-12]。目前研究較多的脫膻方法是微生物發酵法，其主要原理是利用發酵制劑來發酵羊肉，在發酵過程中，微生物的脂肪酶對羊肉的揮發性脂肪酸產生降解作用；另一方面，蛋白酶水解蛋白質生成的肽和氨基酸及脂肪分解生成的脂肪酸進一步通過氧化降解和美拉德反應形成風味物質，使得膻味物質的相對含量減少[13]，從而達到降低羊肉膻味，改善質構、賦予良好風味和色澤且不破壞羊肉品質的目的。HOLKO I等[13]以捷克羊肉和羊尾脂肪為原料，接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）混合的發酵劑制作羊肉發酵香腸。發酵后的羊肉香腸膻味明顯減少，且組織狀態、滋味、色澤都有明顯改善。李秋桐等[14]從貴州火腿和羊養殖場土壤中篩選出11株均能降解膻味脂肪酸的除膻菌株，其中4株能應用于食品工業。

結合傳統發酵肉制品發酵劑的基本標準[15]，應用于羊肉制品的單菌或復合發酵劑具有以下特征：①耐鹽性和耐亞硝酸鹽性，能在6%食鹽和150 mg/kg 亞硝酸鹽中生長良好；②具有一定蛋白質、脂肪分解能力和膻味脂肪酸降解能力；③對人體無害，不具有氨基酸脫羧酶活性；④快速產酸，與有害微生物具有拮抗作用；⑤發酵葡萄糖不產氣，不產粘，不產生H2S和NH3等不良風味氣體，不產生H2O2；⑥發酵菌種間無拮抗作用[15]。

目前國內對羊肉制品發酵劑的發酵特性研究較少，如何選擇合適的發酵劑仍是研究的重點。DUAN Y 等[16]從內蒙古傳統肉腸中分離出69株乳酸菌并對其加工及功能特性進行研究，篩選出8株適合用于發酵羊肉香腸的菌株。本研究選用的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pedicoccus pentosaceus）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）三株發酵菌種，在發酵肉制品中的應用均有報道[15，17]，但在發酵羊肉脫膻的應用鮮見報道。以羊肉制品發酵劑應具有的要求為依據進行研究，篩選適合羊肉制品的發酵菌株，為發酵羊肉制品的生產開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）GIM1.191、戊糖片球菌（Pedicoccus pentosaceus）GIM1.925、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）GIMT1.955：廣東省微生物菌種保藏中心；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）10001、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）10899：中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 化學試劑

4-甲基辛酸標準品（純度≥98%）、4-甲基壬酸標準品（純度≥97.0%）、4-乙基辛酸標準品（純度≥98%）：上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醇、正己烷（均為色譜純）、亞硝酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、濃硫酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；中性紅：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基、營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基、MRS液體培養基、MRS固體培養基、平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基：杭州丁克生物技術有限公司。

葡萄糖產氣培養基、醋酸鉛培養基、產氨培養基、產H2O2培養基、氨基酸脫羧酶培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

耐鹽培養基：分別添加質量分數為0、2%、4%、6%、8%的NaCl到營養肉湯和MRS液體培養基。

耐亞硝酸鹽培養基：分別添加0mg/L、50mg/L、100mg/L、150 mg/L、200 mg/L NaNO2到營養肉湯和MRS液體培養基。

膻味脂肪酸培養基：分別稱取150.0 mg 4-甲基辛酸、4-甲基壬酸和4-乙基辛酸，用正己烷配成500 mL脂肪酸混合液，將脂肪酸混合液分別加入營養肉湯和MRS液體培養基混合均勻（脂肪酸混合液∶培養基=1∶2（V/V））。

1.2 儀器與設備

BioX 2164超凈工作臺：美國BioX公司；LRH-250恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；SN510C全自動高壓滅菌鍋：日本YAMATO公司；UV2550/2450分光光度計：日本島津公司；pHB-1便攜pH計：上海三信儀表廠；Agilent 7890A-5975C氣相色譜質譜聯用（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）儀、DB-23色譜柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取凍存的3株菌株室溫解凍，將肉葡萄球菌劃線培養于營養瓊脂培養基上，植物乳桿菌和戊糖片球菌劃線培養于MRS固體培養基上，在37 ℃條件下培養24 h后，挑取肉葡萄球菌單菌落轉接到營養肉湯培養基，植物乳桿菌和戊糖片球菌單菌落轉接到MRS液體培養基中擴大培養，備用。發酵羊肉制品生產中發酵劑接種量一般不小于107CFU/g[18]，3株菌株傳代活化3次，培養24 h后活菌數均為108CFU/mL，滿足生產接種量的需要。

1.3.2 生長曲線和產酸特性的測定

取活化的3株菌株，按1%（V/V）的接種量將肉葡萄球菌接種到營養肉湯培養基，植物乳桿菌和戊糖片球菌接種到MRS液體培養基，37 ℃條件下培養24 h，每2 h測定菌液在波長600 nm條件下的吸光度值（OD600nm值）和pH值，以空白液體培養基為對照。

1.3.3 菌株的發酵特性試驗

（1）耐鹽特性和耐亞硝酸鹽特性的測定

取活化的3株菌株，按1%（V/V）接種量分別接種到耐鹽培養基和耐亞硝酸鹽培養基中，37 ℃條件下培養48 h后，測定其在波長600 nm條件下的吸光度值（OD600nm值），以空白液體培養基為對照。

（2）葡萄糖產氣試驗

將1%（V/V）活化菌種接種到葡萄糖產氣培養基中，37℃條件下培養24 h，觀察培養基是否顏色變黃和有氣泡產生。

（3）產粘性試驗

將1%（V/V）活化菌種接種到營養瓊脂和MRS固體培養基中，37 ℃條件下培養24 h，挑取菌落觀察有無粘絲。

（4）產氨試驗

將1%（V/V）活化菌種接種到產氨培養基中，37 ℃條件下培養24 h，向培養基中滴加3～5滴氨試劑，觀察是否有黃色或棕紅色沉淀產生。

（5）產H2S試驗

將活化菌種劃線于醋酸鉛培養基上，37 ℃條件下培養24 h，觀察是否出現黑色沉淀線，如果出現黑色則為陽性，無黑色為陰性。

（6）產H2O2試驗

將活化菌種劃線于產H2O2下層培養基上，之后傾注一層上層培養基，37 ℃條件下培養72 h，觀察菌落周圍是否變澄清。

（7）氨基酸脫羧酶試驗

將1%（V/V）活化菌種接種到氨基酸脫羧酶培養基，37 ℃條件下培養24 h，觀察培養基顏色是否變紫色或紫紅色。

1.3.4 菌種間的拮抗試驗

參考何健葉[19]的方法，將活化后的菌種在營養瓊脂培養基上劃一直線，37 ℃條件下培養24 h，沿菌落邊緣垂直方向接另一種菌，37 ℃條件下培養24 h，觀察有無抑菌圈。

1.3.5 抑菌試驗

參考段艷[20]的方法并略做修改。以大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，吸取200 μL的活化三代的指示菌懸液（106CFU/mL）均勻涂布于營養瓊脂培養基上。在培養基上間隔打孔（6 mm），分別向孔中加入50 μL 活化菌種上清液（4 ℃、8 000 r/min離心10 min），37 ℃條件下培養48 h。觀察孔周圍是否出現抑菌圈并記錄抑菌圈直徑，空白對照為液體培養基。抑菌圈直徑大于10 mm表示菌株具有抑菌活性[21]。

1.3.6 分析檢測

（1）蛋白酶和脂肪酶特性的測定

蛋白酶特性的測定參考于麗梅等[22]的方法并略作修改，取活化的3株菌株分別均勻涂布在含有15%（g/g）脫脂乳粉的營養瓊脂培養基和MRS固體培養基中，37 ℃條件下培養48 h。觀察菌落情況，當脫脂乳中蛋白質被分解后菌落周圍會出現透明圈，以此判斷菌株是否有蛋白酶活性。

脂肪酶特性的測定參考李秋桐等[14]的方法并略作修改，取活化的3株菌株分別均勻涂布在含有15%羊油乳化劑（羊油∶20 g/L聚乙烯醇=1∶4（g∶g））和中性紅指示劑的營養瓊脂培養基和MRS固體培養基中，37 ℃條件下培養48 h。當培養基中的脂肪被分解生成脂肪酸，指示劑變色出現紅色斑點，以此判斷菌株是否有脂肪酶活性。

（2）膻味脂肪酸的測定

通過GC-MS測定膻味脂肪酸含量，其色譜條件如下：色譜柱使用DB-23毛細管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（He），流速1.0 mL/min，分流比10∶1，進樣量1.0 μL，進樣口溫度270 ℃，傳輸線溫度230 ℃，離子源溫度220 ℃，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，柱升溫程序：初始100 ℃保持2 min，6.0 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。通過與標準曲線的對照計算膻味脂肪酸含量。

參考李秋桐等[14]的方法并做一定修改，取活化的3株菌株，按1%（V/V）接種量分別接種到膻味脂肪酸培養基中，在37 ℃、180 r/min條件下培養48 h之后，加入10 mL正己烷充分振蕩，8 000 r/min離心15 min，取上清液甲酯化[23]，以空白液體培養基為對照。膻味脂肪酸降解率計算公式如下：

1.3.7 數據處理

所有數據均重復3 次取平均值，使用SPSS 22.0進行單因素方差分析，使用OriginPro 2016進行圖表的制作與處理。數據以“平均值±標準差”的形式表示。

2 結果與分析

2.1 菌種生長曲線和產酸特性

一般處于對數生長期末期至穩定期前期的菌株的代謝活性最強[24]，此狀態下的菌株適合用于生產發酵羊肉制品。通過測定三株菌種的生長曲線，可以確定其生長規律和最佳收集時間。pH作為發酵肉制品一個關鍵因素，一定程度上影響著產品的質量。pH過低會影響產品的酸度和口感，過高則無法抑制發酵過程中雜菌的生長，從而引起肉制品的腐敗變質。所以發酵劑的選擇也需要考慮其產酸特性。

圖1 三株菌株的產酸特性（A）及生長曲線（B）Fig.1 Acid production characteristics (A) and growth curves (B) of three strains

由圖1A可知，2株乳酸菌的pH下降趨勢與生長趨勢（OD600nm值）呈正相關。pH值下降速率在對數生長期較快，進入穩定期則減小，原因可能是乳酸菌在對數期生長代謝旺盛，相關酶系活躍，乳酸產生速率較快，在穩定期時營養物質的消耗和比例失調以及代謝產物積累，抑制微生物代謝，產酸速率減小，這與樊明明[25]的實驗結果基本一致。由圖1B可知，植物乳桿菌和戊糖片球菌0～4 h處于延滯期，4 h后進入對數生長期，植物乳桿菌和戊糖片球菌分別在18 h 和16 h后進入穩定期。較短的延滯期后呈對數增長，有利于2株乳酸菌在發酵體系中迅速成為優勢菌，抑制雜菌和有害微生物的生長，保證產品的安全性。肉葡萄球菌0～4 h處于延滯期，2 h后進入對數生長期，16 h后進入穩定期。肉葡萄球菌產酸能力較弱，培養24 h后的pH值為6.1，在發酵羊肉制品的生產中不適合作為單菌發酵劑使用。何健葉[19]也得到相似實驗結果。

2.2 菌種耐鹽特性

食鹽因其調味和防腐作用，在發酵肉制品的加工中必不可少。食鹽濃度過高時，會抑制發酵菌的生長，濃度過低時則無法抑制雜菌和病原菌的生長。三株菌耐鹽特性結果見圖2。

圖2 三株菌株的NaCl耐受性Fig.2 NaCl tolerance of three strains

由圖2可知，植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌均有良好的耐鹽性，隨著NaCl質量分數的增加，菌體濃度均受到抑制。在NaCl質量分數為6%時，植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌生長較好，當NaCl質量分數為8%時，三種菌OD600nm值下降顯著，下降率分別為42.33%、35.10%、22.51%。張超等[26]對菌種耐鹽性的研究中也有類似的結果。原因可能是隨著鹽濃度的增加，滲透壓變化引起菌種細胞結構損傷，影響其生理代謝活動，甚至破裂死亡。發酵肉制品中食鹽添加量一般是6%左右。因此從耐鹽性方面來看，植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌均適合作為羊肉制品的發酵菌種。

2.3 菌種耐亞硝酸鹽特性

亞硝酸鹽作為肉制品護色劑，常應用于肉制品的發色，同時具有增加風味和防腐的作用。亞硝酸鹽毒性較大，但目前在肉制品中的作用還無法被完全替代。三株菌耐亞硝酸鹽特性結果見圖3。由圖3可知，隨著亞硝酸鈉質量濃度的增加，菌種的OD600nm值呈下降趨勢，菌種的生長受到了抑制。當亞硝酸鈉質量濃度為200 mg/L時，植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌的OD600nm值分別下降了55.45%、49.82%和42.74%。這與劉蘭[27]關于菌種耐亞硝酸鹽特性的研究結果相一致。發酵肉制品中亞硝酸鹽的添加量最大為150 mg/kg左右，3株菌在亞硝酸鹽的質量濃度為150 mg/L時均可正常生長，所以從耐亞硝酸鹽方面來看，植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌均適合作為羊肉制品的發酵菌種。

圖3 三株菌株的NaNO2耐受性Fig.3 NaNO2 tolerance of three strains

2.4 菌種蛋白酶和脂肪酶特性

OJHA K S等[28-29]利用具有蛋白酶和脂肪酶活性的嗜酸乳桿菌和微球菌發酵豬肉火腿，發酵后的火腿游離氨基酸和游離脂肪酸含量均比未發酵的火腿高。肉制品發酵過程中，在微生物分泌的蛋白酶和脂肪酶及內源性組織酶作用下，肉中的蛋白質和脂肪發生水解，肌肉結構破壞，水解產物經過氧化降解反應生成揮發性風味物質，從而改善羊肉制品的質構和風味。由表1可知，肉糖葡萄球菌和戊糖片球菌均具有蛋白酶和脂肪酶活性，植物乳桿菌可分泌蛋白酶，不分泌脂肪酶。

表1 三株菌株的蛋白酶和脂肪酶特性Table 1 Protease and lipase activities of three strains

2.5 菌種間的拮抗作用

大量研究表明，多菌種混合發酵的效果優于單菌種發酵，彌補單菌發酵的風味不足的缺點[17]。乳酸菌在代謝過程中可能會產生細菌素，抑制葡萄球菌生長，影響復合菌種的發酵性能。所以在進行混合菌種發酵時，應確定各菌種之間是否存在抑制作用，結果見表2。由表2可知，培養基上沒有抑菌圈，三株菌種間均無拮抗作用，可以復配成發酵劑應用于發酵羊肉制品。

表2 三株菌株間的拮抗作用Table 2 Antibiosis between three strains

2.6 菌種的抑菌能力

乳酸菌在肉制品發酵過程中會產生乳酸降低發酵體系的pH并產生細菌素，抑制腐敗菌和致病菌的生長繁殖[30]，提高產品的安全性。由表3可知，三株菌的代謝產物對大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用（抑菌圈直徑≥10 mm），植物乳桿菌和戊糖片球菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力顯著高于肉葡萄球菌（P＜0.05）。

表3 三株菌株抑菌能力的測定結果Table 3 Determination results of antibacterial activities of three strains

2.7 菌種降解膻味脂肪酸的能力

利用微生物對膻味脂肪酸的降解作用，將其制成發酵劑用來發酵羊肉是一種有效的脫膻方法，因此應用于羊肉發酵的發酵劑必須考察其降解膻味脂肪酸的能力。各菌株發酵后對膻味脂肪酸降解能力見表4。由表4可知，植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌對4-甲基辛酸、4-甲基壬酸和4-乙基辛酸均有一定的降解能力，其中肉葡萄球菌對膻味脂肪酸的降解能力顯著高于植物乳桿菌和戊糖片球菌（P＜0.05），對4-甲基辛酸、4-乙基辛酸和4-甲基壬酸的降解率分別為82.10%、81.43%和75.70%。戊糖片球菌對4-甲基辛酸和4-乙基辛酸降解能力顯著高于植物乳桿菌（P＜0.05），對4-甲基壬酸的降解能力和植物乳桿菌無顯著性差異（P＞0.05）。李秋桐等[14]從貴州火腿和羊養殖場土壤中篩選出的11株除膻菌株，對4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的降解率分別為30%～70%和10%～70%。LU Y等[11]在牛肉和豬肉中加入膻味脂肪酸可模擬羊肉的風味，通過戊糖片球菌發酵48 h后有效消除了豬肉和牛肉的膻味。從降解膻味脂肪酸方面來看，植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌均適合作為羊肉制品的發酵菌種。

表4 三株菌株降解膻味脂肪酸的結果Table 4 Results of odour fatty acids degrading ability of three strains

2.8 其他發酵特性

發酵菌種代謝產生粘液，會影響到羊肉制品的外觀和內部組織結構；發酵產氣的菌種分解糖類產生的氣體一定程度上會影響羊肉制品的致密結構；發酵過程中產生H2S和NH3等不良風味的氣體，會影響羊肉制品的品質和風味[31]；菌種代謝產生H2O2會氧化不飽和脂肪酸和血紅素從而影響產品的風味和色澤[32]；具有氨基酸脫羧酶活性的菌種在發酵過程會使氨基酸脫羧產生酪胺、組胺等生物胺類物質[33]。植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌的其他發酵特性見表5。由表5可知，三株菌在培養過程中均不產氣、不產粘，不產H2S和NH3等不良風味氣體，不產H2O2，氨基酸脫羧酶活性為陰性，表明三株菌種均符合發酵羊肉制品發酵劑的基本要求，對肉制品的品質和風味無不良影響，可用于羊肉制品的發酵。

表5 三株菌株的發酵特性Table 5 Fermentation characteristics of three strains

3 結論

本研究以羊肉制品發酵劑應具有的基本要求為依據，通過對植物乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌的產酸特性、耐鹽性、耐亞硝酸鹽、降解膻味脂肪酸的能力及其他發酵特性等進行研究。結果表明，三株菌種均對食鹽和亞硝酸鹽具有較好的耐受性，能在6%的食鹽溶液和150 mg/L亞硝酸鹽溶液中存活，產酸能力較強，除植物乳桿菌無脂肪酶活性外，均具有蛋白質和脂肪降解能力，能夠有效降解膻味脂肪酸，對羊肉制品的風味和品質沒有不良影響，能有效抑制有害微生物生長，基本符合發酵羊肉制品發酵劑的生產要求。三株菌種之間無明顯拮抗作用，可根據實際生產要求復配作為羊肉制品的復合發酵劑，進一步應用于發酵羊肉制品的生產和開發。