南寧地區米酒曲中酵母菌的分離鑒定及其在紅棗酒中的應用

崔夢君，席 啦，朱妞妞，單春會，鐘小丹，趙慧君，郭 壯

（1.湖北文理學院食品科學技術學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽 441053；2.石河子大學食品學院，新疆石河子 832000；3.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北孝感 432003）

果酒是以水果為原料，在酵母菌的作用下，將水果中自身含有及外源加入的糖分轉化為酒精而制成的一類發酵酒[1]。因不僅具有水果的清香，同時含有對人體有益的營養物質，果酒深受廣大消費者的喜愛。果酒加工也被認為是提高農產品附加值和延長水果種植產業鏈的有效方式之一。然而目前我國果酒加工使用的發酵劑呈現出產品單一且菌株多來源于國外的不足，在一定程度上限制了我國果酒行業的發展[2]。作為我國特色發酵酒，白酒、黃酒和米酒釀造時均需使用酒曲，酒曲的微生物群系較為復雜，除含有乳酸菌和霉菌外，亦含有大量的酵母菌[3]，因而從中分離、保藏并篩選酵母菌用于果酒加工具有較強的可行性。

米酒曲中的酵母菌多樣性較高且種系獨特，尤其是蘊含了大量的扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[4]。作為果酒發酵中最常用的菌株，S.cerevisiae廣泛應用于葡萄、獼猴桃和荔枝等果酒的釀造[5]。雖然國內應用尚少，但S.fibuligera的高產酯能力、高糖化力和高蛋白酶活性決定了其在制酒工業中具有較大的應用潛力[6]。紅棗在我國的種植面積超2 000萬畝，年產量近千萬噸，具有糖分高且香味濃郁的特點，較為適合果酒的加工[7]。研究表明，紅棗酒中富含的氨基酸不僅具有較高的營養價值且能影響果酒滋味品質的形成[8]。亦有研究表明，不同酵母菌菌株在果酒中的代謝差異較大，且這種差異直接影響了果酒的風味品質[9]。

本研究對廣西省南寧市米酒曲中的酵母菌進行了分離鑒定，選取其中的S.cerevisiae和S.fibuligera進行了紅棗酒制備，同時采用氨基酸分析儀和氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對其氨基酸和揮發性風味物質種類及含量進行了解析，以期為后續紅棗果酒發酵劑的研制提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗（Jun jujube）：購于新疆維吾爾自治區石河子市；白砂糖：柳州市柳冰食品廠；偏重亞硫酸鉀：意大利ESSECO集團；果膠酶（50 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：北京博奧星生物技術有限公司；十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、酚、氯仿、異戊醇、乙酸鈉、乙醇和乙二胺四乙酸：國藥集團化學試劑有限公司；聚合酶、10×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）緩沖溶液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）混合液、2×PCR混合液和pMD18-T克隆載體：大連寶生物技術有限公司；正向引物（NS1：5'-CATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和反向引物（NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）：武漢天一輝遠生物科技有限公司；PCR清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發展有限公司；大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）top10：鄂西北傳統發酵食品研究所保存；氨基酸分析儀配套緩沖溶液：英國Biochrom公司。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Veriti FAST梯度PCR儀：美國ABI公司；9231破壁榨汁機：奧克斯集團有限公司；LRH-150生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；QYC-2102C全溫培養搖床：上海新苗醫療器械制造有限公司；Biochrom 30+氨基酸分析儀：英國Biochrom公司；GCMS-QP2020氣相色譜-質譜聯用儀：島津企業管理中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

從廣西省南寧市淡春菜市場、官塘綜合市場和北湖農貿市場采集米酒曲樣品10 份，所有米酒曲均無蟲蛀和發霉現象，均在南寧市本地制作和銷售。

1.3.2 酵母菌的分離、純化和鑒定

使用研缽將米酒曲粉碎，取1 g加入99 mL生理鹽水中，錐形瓶置于搖床25 ℃振蕩30 min后按照10 倍梯度進行倍比稀釋，取10-3～10-53個梯度的菌懸液涂布于PDA培養基上，25 ℃有氧恒溫培養2～5 d，挑選具有典型酵母菌形態特征的菌落進行純化和凍藏。采用消解酶-氯化芐法進行酵母菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取[10]，PCR擴增體系：10×PCR 緩沖液（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mol/L）2μL，正向引物和反向引物各0.5μL，聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板1 μL，無菌水18 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃再延伸10 min[11]。擴增產物經純化、連接和轉化后，挑取陽性克隆子送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序，反饋回的序列與美國國家生物技術信息中心的GenBank數據庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對進而明確其種系型。

1.3.3 紅棗酒的制備

（1）紅棗清洗去核，按照1∶5的質量比加入純水，同時加入總質量0.006%（質量比）的偏重亞硫酸鉀，打漿；（2）加入3%果膠酶，45 ℃酶解1 h；（3）酶解后紅棗汁的可溶性固形物含量約為13.0°Bx，用白砂糖將其調至22°Bx后，用酒石酸調pH值至3.9；（4）按照5×107CFU/mL紅棗漿的比例接入

1.3.2 中鑒定為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的分離株，同時設置不添加酵母菌而自然發酵的樣品為對照組；（5）罐口采用4層紗布進行封口，22 ℃恒溫發酵，為比較不同分離株的發酵特性，若有1 個分離株制備的樣品糖度72 h保持不變，則視為所有樣品發酵結束；（6）紅棗酒用紗布過濾后，濾液10 000 r/min離心6 min，上清備用[12]。

1.3.4 測定方法

紅棗酒酒精度的測定：使用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中約束的密度瓶法。

紅棗酒中氨基酸含量的測定：參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。使用Biochrom 30+氨基酸分析儀，配置磺酸型陽離子樹脂色譜柱進行氨基酸含量和種類分析，溫度梯度38 ℃、50 ℃和93 ℃，檢測波長440 nm和570 nm，流速35 mL/h，緩沖液1、2、5和6分別洗脫9 min、12 min、20 min和6 min。

基于GC-MS對紅棗酒中揮發性物質含量的測定：參照文獻[13]的方法進行揮發性物質含量測定，并進行適當修改。（1）取10 mL紅棗酒于20 mL樣品瓶，鋁帽封口；（2）H-Rtx-Wax色譜柱（30 m×2.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度200℃，高純氦氣（He）和氮氣（N2）為載氣（純度＞99.999 9%），分流比10∶1，流速1 mL/min；起始溫度30 ℃，保持3 min，以3 ℃/mm升至45 ℃，保持10 min，然后以8 ℃/min升至130 ℃，不保持，然后以10 ℃/min升至200 ℃保持7 min；（3）電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，連接口溫度280 ℃，電子轟擊能量70 eV；m/z范圍33.00～450 amu，采集方式Q3 Scan；（4）使用美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）14標準質譜庫根據化合物保留指數進行定性分析，利用峰面積占總峰面積的比值對主要化合物進行相對定量分析。

1.3.5 統計分析

使用方差分析對紅棗酒酒精度差異性進行分析；使用R軟件（V3.6.2）繪制氣泡圖；使用Origin2017軟件繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離鑒定

將本研究分離的酵母菌進行26S rRNA測序，返回的序列在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對，結果如表1所示。

表1 分離酵母菌26S rRNA序列同源性比對結果Table 1 Result of homology comparison of 26S rRNA sequences of isolated yeast strains

由表1可知，20 株酵母菌與模式株參比序列同源性均在99%以上，被鑒定為5個屬的5個種，其中菌株HBUAS61051等10株菌被鑒定為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），占分離株總數的50%；菌株HBUAS61054等5株菌被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），占分離株總數的25%；菌株HBUAS61059等3株菌被鑒定為弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii），占分離株總數的15%；菌株HBUAS61058和菌株HBUAS61072分別被鑒定為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）和Yamadazyma mexicana，各占分離株總數的5%。由此可見，南寧地區米酒曲中酵母菌多樣性較高，且以S.fibuligera為主。

2.2 紅棗酒酒精含量的分析

本研究使用分離到的10 株S.fibuligera和5 株S.cerevisiae進行了紅棗酒的制備，并以不接入酵母菌且自然發酵的樣品為對照，探討了其對紅棗酒酒精度、氨基酸和揮發性風味物質種類及含量的影響。紅棗酒酒精度如圖1所示。

圖1 不同菌株釀制的紅棗酒酒精度Fig.1 Alcohol contents of jujube wine brewed with different strains

由圖1可知，較之自然發酵，多數接種酵母菌釀造的紅棗酒酒精度均顯著提升（P＜0.05），其中S.fibuligeraHBUAS61053和S.cerevisiaeHBUAS61071釀造的紅棗酒酒精度最高，均為12.3%vol。而S.fibuligeraHBUAS61051、S.fibuligeraHBUAS61066和S.cerevisiaeHBUAS61070釀造的紅棗酒酒精度均約為7.5%vol，與自然發酵紅棗酒酒精度差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，雖然接種酵母菌可縮短紅棗酒的發酵周期，但不同菌株間存在一定差異。

2.3 紅棗酒氨基酸種類和含量的分析

紅棗酒中氨基酸種類及含量如表2所示。由表2可知，接種酵母菌發酵的紅棗酒共檢測出必需氨基酸5種，非必需氨基酸7種，平均氨基酸總量為3271.93mg/L，其中必需氨基酸283.88 mg/L，非必需氨基酸2 988.05 mg/L；除酪氨酸外，自然發酵紅棗酒中共檢測出必需氨基酸5種，非必需氨基酸6 種，氨基酸總量為1 926.30 mg/L，其中必需氨基酸223.62 mg/L，非必需氨基酸1 702.68 mg/L。脯氨酸和天冬氨酸為2 種紅棗酒中的主要氨基酸，在接種酵母菌發酵的紅棗酒中平均含量分別為1 857.93 mg/L和771.59 mg/L，而在自然發酵紅棗酒中含量分別為1057.97mg/L和441.16mg/L。值得一提的是，必需氨基酸與氨基酸總量的比值在接種酵母發酵和自然發酵紅棗酒中分別為8.7%和11.6%，而必需氨基酸與非必需氨基酸的比值在2類紅棗酒中分別為9.5%和13.1%。由此可見，接種酵母菌釀造的紅棗酒中氨基酸種類和含量均明顯提升，但增量主要體現在脯氨酸和天冬氨酸等非必需氨基酸上。

表2 紅棗酒中氨基酸種類及含量Table 2 Types and contents of amino acids in jujube wine

由表2可知，丹陽封缸酒中必需氨基酸與氨基酸總量的比值為42.4%，而必需氨基酸與非必需氨基酸的比值高達73.6%。由此可見，紅棗酒中氨基酸總量明顯高于丹陽封缸酒，但其氨基酸種類較之丹陽封缸酒偏少，且主要以非必需氨基酸為主。本研究進一步對紅棗酒中呈味氨基酸的構成進行了分析，結果如表3所示。

表3 紅棗酒中呈味氨基酸的構成Table 3 Composition of flavor amino acids in jujube wine

由表3可知，接種酵母菌發酵和自然發酵的紅棗酒中甘味呈味氨基酸含量均最多，分別為1 319.33 mg/L和2 230.75 mg/L，占氨基酸總量的68.5%和68.2%；其次為酸味呈味氨基酸，含量分別為441.16 mg/L和771.59 mg/L，占氨基酸總量的22.9%和23.6%；而澀、苦和鮮味呈味氨基酸的含量均相對較少。由此可見，甘味和酸味呈味氨基酸為紅棗酒中主要呈味氨基酸，2 類紅棗酒中呈味氨基酸的構成比例無明顯差異。由表3亦可知，丹陽封缸酒中甘味呈味氨基酸平均含量最高，占氨基酸總量的56.4%，其次為澀味和苦味呈味氨基酸，含量分別為19.6%和14.9%，而酸味和鮮味呈味氨基酸均較少。由此可見，紅棗酒和丹陽封缸酒在呈味氨基酸構成上存在明顯的差異。

2.4 紅棗酒揮發性風味物質種類及含量的分析

果酒中通常含有多種揮發性風味物質[16]，其中醇類化合物在果酒中主要發揮呈香呈味的作用，對果酒的香氣和味道形成有著重要影響[17]；酯類化合物是酵母進行酒精發酵時的次級代謝產物，乙酸乙酯和己酸乙酯等酯類化合物具有明顯的果香特性[18-19]；醛類化合物多源于醇類的氧化或酸類物質的還原，亦是果酒的重要呈味物質[20]。紅棗酒中揮發性風味物質種類及含量的分析如表4所示。

由表4可知，峰圖中約有80%左右的化合物可以被鑒定，2類紅棗酒共檢測出40種揮發性風味物質，包括酯類25種，醇類9種，醛類5種和胺類1種。酵母菌發酵紅棗酒共檢測出35種揮發性風味物質，其中酯類、醇類和醛類物質分別為22種、8種和4種，平均相對含量依次為13.26%、50.72%和13.20%；自然發酵紅棗酒共檢測出28 種揮發性風味物質，其中酯類、醇類和醛類物質分別為21種、4種和3種，相對含量依次為8.04%、62.04%和2.94%。由此可見，接種酵母菌發酵可提升紅棗酒中酯類物質的相對含量。紅棗酒中相對含量大于1.0%揮發性風味物質的氣泡圖如圖2所示。

表4 紅棗酒中揮發性風味物質中化合物的種類數量Table 4 Types and numbers of volatile flavor compounds in jujube wine

圖2 紅棗酒中平均相對含量＞1.0%揮發性風味物質的氣泡圖Fig.2 Bubble chart of volatile flavor substances in jujube wine with average relative content more than 1.0%

由圖2可知，紅棗酒中有8 類化合物的平均相對含量大于1.0%，其中酯類2 種、醇類4 種和醛類2 種。異戊醇和乙酸乙酯為酵母菌發酵紅棗酒中主要揮發性風味物質，平均相對含量分別為33.03%和24.37%，兩者亦為自然發酵紅棗酒中的主要揮發性風味物質，平均相對含量分別為18.91%和51.34%。

3 結論

南寧地區米酒曲中酵母菌多樣性較高，且以S.fibuligera為主。使用S.fibuligera和S.cerevisiae分離株進行紅棗酒制備發現，脯氨酸和天冬氨酸為紅棗酒中的主要氨基酸，甘味和酸味氨基酸為主要呈味氨基酸，異戊醇和乙酸乙酯為主要揮發性風味物質。較之自然發酵，接種酵母菌發酵可縮短紅棗酒的發酵周期，提升脯氨酸和天冬氨酸等非必需氨基酸的含量，同時提升紅棗酒揮發性風味物質中酯類化合物的相對含量。