納豆芽孢桿菌發酵菜用大豆中納豆激酶的提取及其性質分析

李秀涼，李倩文，朱 玉，韓曉云，孫慶申，宋 永

（1.黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500；2.黑龍江大學生命科學學院黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080；3.黑龍江大學生命科學學院黑龍江省普通高等學校微生物重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080）

納豆激酶（nattokinase，NK）是從傳統發酵食品納豆中獲得的一種絲氨酸蛋白酶，是微生物中唯一的纖維蛋白溶解酶[1-2]，因其具有極強的溶栓活性、安全、高效、體內半衰期長等特點，被認為是一種很有研究價值和應用前景的溶栓劑，它不僅可預防血栓形成，還能抵抗高血壓和動脈粥樣硬化等疾病的發生[3]。有研究將納豆激酶與野櫻莓、紅參和香菇復配，該產品具有消炎和抗氧化作用，從而能改善胰島素分泌，緩解2型糖尿病癥狀及其并發癥[4]。此外，近期研究發現納豆激酶還具有抑制乳腺癌細胞生長的功能[5]。

目前市面上納豆激酶的主要來源是納豆。納豆是一種傳統的發酵保健食品，由煮熟的大豆接種納豆菌發酵制得[6]，它作為一種歷史悠久的傳統食物，其中的活性成分賦予了納豆多種保健功能[7-8]，因此，各種納豆深加工產品如納豆激酶軟糖、壓片糖果和膠囊等相繼出現[9]。近年來，各國學者對納豆開展了廣泛的研究，包括菌種分離[2]，不同原料制備納豆[10-12]，納豆激酶發酵條件的優化[13-14]、分離提取、酶學性質研究[15-17]等。

菜用大豆也叫鮮食大豆，其主要特點在于鮮采食用，含有豐富的營養元素及食用蛋白質，對預防心腦血管疾病具有一定效果[18]。以菜用大豆等外品作為發酵原料，生產納豆激酶，不僅能夠提高這些菜用大豆的附加值，也為相關企業延伸產業鏈提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌粉：日本有限會社高橋祐藏研究所；菜用大豆：山東陽光農業生物科技有限公司；瓊脂糖（生化試劑）、微生物納豆激酶酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司；凝血酶（1 000 U）、尿激酶（58 491 IU/mL）、纖維蛋白原（蛋白含量50%～70%）、二乙氨乙基（dicthylaminoethyl，DEAE）陰離子交換柱（S14024-100g）：上海源葉生物科技有限公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：江蘇凱基生物技術股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

MLS-3781-PC高壓蒸汽滅菌鍋：日本松下健康醫療器械；SW-CJ-2F（D）生物潔凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；VersaMAX美谷MD酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；A560型雙光束紫外可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；BSZ-160自動部份監測器：上海精科實業有限公司；BTP冷凍干燥機：美國SP Virtis公司；HZQ-X 100振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆的制備工藝流程

菜用大豆→挑選、清洗→滅菌蒸熟→接種→發酵→4 ℃后熟→納豆成品

操作要點：

菜用大豆經過挑選，以除去過于破碎的豆粒，再經過清洗、瀝干，稱取一定質量后分裝入三角瓶，用三層紗布封口后蒸熟（121 ℃恒溫15 min），然后保持其溫度在50 ℃左右備用。稱取納豆芽孢桿菌直投式菌粉0.1 g，加入40 ℃左右的溫水10 mL進行混勻，取樣進行適度稀釋后，通過平板計數確定每毫升菌液中的活菌數以后，向蒸熟的菜用大豆中接入不同體積的菌液，并混勻，用紗布封口后放置于不同溫度（35～41 ℃）恒溫培養箱中，保持紗布的濕潤，防止水分的蒸發。在發酵不同時間點將發酵好的納豆從培養箱中取出，放入4 ℃冰箱中后熟不同時間，得到不同的納豆成品。

1.3.2 納豆激酶提取液的制備

將后熟好的納豆取出，倒入平板中于-20 ℃預凍6 h后，真空冷凍干燥過夜，凍干后使用萬能粉碎機進行打粉，將納豆凍干粉和生理鹽水按照料液比為1∶10（g∶mL）的比例混勻，放入4 ℃冰箱中鹽溶12 h后，在4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，保留的上清液使用醫用脫脂棉過濾掉脂肪組織和其他的不溶物質，處理后所得的澄清液體即為納豆激酶提取液。

1.3.3 蛋白質含量和納豆激酶活性分析

（1）蛋白質含量測定

利用BCA試劑盒測定納豆激酶提取液中的蛋白質含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。在562 nm波長條件下測得標準蛋白含量（x）與吸光度值（y）關系曲線的回歸方程為y=0.055 8x+0.112 1（R2=0.999 1）。根據標準曲線回歸方程計算納豆激酶粗提液中的蛋白質含量。

（2）納豆激酶活性測定

采用酶聯免疫吸附法[2]，具體操作按照試劑盒說明書進行，以空白孔調零，依序測量各孔的吸光度值（OD450nm值），在加終止液后15 min內完成測定。

1.3.4 納豆發酵條件的優化

單因素試驗：以納豆激酶活性為評價指標，根據納豆發酵工藝的關鍵點設計發酵時間（12 h、24 h、36 h、48 h）、發酵溫度（35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、接種量（0.580×1011CFU/100 g、1.150×1011CFU/100 g、1.730×1011CFU/100 g、2.300×1011CFU/100 g）和后熟時間（6 h、12 h、18 h、24 h）4個影響因素。

在單因素試驗基礎上，選取發酵時間、接種量、后熟時間3個單因素，每個因素設置3個水平，每個水平進行3次重復，以確定產酶活最佳發酵條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 納豆發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of natto

1.3.5 納豆激酶的純化

（1）硫酸銨分段鹽析

取30 mL納豆激酶粗提液，采用固體加入法向其中緩慢地加入研磨后的硫酸銨固體粉末，使其最終分別達到20%、40%、60%和80%的飽和度，并在4 ℃條件下靜置過夜析出蛋白質。然后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，將沉淀用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液復溶后，裝入事先預處理好的透析袋（截留分子質量為8 000～14 000 Da，納豆激酶的分子質量＞14 000 Da，所以會留在透析袋內）中，兩端夾好，確保沒有液體漏出。處理好后放入蒸餾水中在4 ℃下透析24 h，每隔4 h更換一次蒸餾水，透析后測定蛋白質含量及酶活性。以硫酸銨飽和度（%）為橫坐標，總蛋白含量（μg）和總酶活力（IU）為縱坐標作雙Y軸折線圖。

（2）DEAE陰離子交換柱處理

本實驗選用了DEAE陰離子交換柱層析純化納豆激酶，具體操作如下：填料（DEAE）保存于體積分數75%乙醇溶液中，用時先將乙醇傾倒出，再用蒸餾水反復清洗至沒有乙醇味，用超聲波儀除去氣泡。然后取50 cm×φ1.5 cm的層析柱關閉其出水口并向其注入1/3柱高的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，然后緩慢加入溶脹好的柱填料，小心傾倒，防止氣泡產生，同時打開出水口，使其在距離柱頂的1/3處時停止沉降。當上層溶液完全澄清，就可以打開恒流泵用適當流速壓柱子，填料的體積不再變化后，繼續平衡一段時間后，將1.5 mL樣品加入填料的上方，待樣品完全進入柱填料后，開始用1.5 mL/min的流速進行洗脫，用紫外分光光度計在波長280 nm條件下進行檢測，自動部份收集器收集吸收峰，然后進行冷凍干燥，于-20 ℃條件下備用保存。

（3）SDS-PAGE電泳檢測

參考文獻[19]的方法配制分離膠和濃縮膠。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）垂直板電泳法，比較各步分離純化效果，并測定納豆激酶的分子質量。

1.3.6 納豆激酶酶學性質

最適溫度：將所得納豆激酶粗酶液分別置于30℃、37℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃反應15 min，加入制備好的纖維蛋白平板的孔中，37 ℃保溫18 h，測量透明溶圈直徑，以其中最高酶活力時的溫度相對應的納豆激酶的酶活力為100%，其余溫度下的酶活力與最高酶活力的比值為該溫度條件下的相對酶活力。

熱穩定性：將所得納豆激酶粗酶液在不同溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）分別處理10 min、20 min、30 min、60 min后，立即冰浴冷卻，確定酶的熱穩定性。以不做任何熱處理的酶液的酶活力為100%，其余溫度下的酶活力與最高酶活力的比值為該溫度下的相對酶活力。

最適pH：將所得納豆激酶粗酶液分別與pH值為2～12的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）反應15 min，加入到制備好的纖維蛋白平板中的孔中保溫18 h，以其中最高酶活力時的pH值相對應的納豆激酶的酶活力為100%，其余pH值下的酶活力與最高酶活力的比值為該pH值下的相對酶活力。

pH值穩定性：將所得納豆激酶粗酶液分別與不同pH值（5～10）的緩沖液混合均勻，在37 ℃條件下處理1 h后測定酶活性，以其中最高酶活力時的pH值相對應的納豆激酶的酶活力為100%，其余pH值下的酶活力與最高酶活力的比值為該pH值下的相對酶活力。

1.3.7 納豆激酶體外溶栓效果的研究

取新鮮豬血于燒杯中使其凝固，將其切割成大小均勻、質量相近的血凝塊，吸干多余水分后準確稱質量，分別置于試管中。分別取經過硫酸銨分段鹽析并透析后的凍干酶粉10 mg和20 mg溶于1 mL生理鹽水，混合均勻后加入試管內（10 mg/mL的酶活力大小約為2 285.33 IU/mL，20 mg/mL約為4 556.98 IU/mL）。以生理鹽水為對照組，每組設置3個平行，在37 ℃恒溫下水浴，分別在5 h和10 h后將血凝塊取出，吸干多余水分后稱質量。血凝塊的溶解率計算公式如下：

式中：m為溶解前血塊質量，g；m1為溶解后血塊質量，g。

1.3.8 數據處理

所有實驗進行3次重復，利用Origin 9.0軟件進行數據分析，結果表示為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 菜用大豆產納豆激酶發酵條件優化的單因素試驗

2.1.1 發酵時間對酶活性的影響

按照每100 g滅菌蒸熟后的菜用大豆中接種1.150×1011CFU/100 g納豆枯草芽孢桿菌直投式發酵劑，于37 ℃分別靜置培養12 h、24 h、36 h、48 h，發酵完成后放入4 ℃冰箱中后熟12 h，分別測定納豆激酶活性，結果見圖1。

圖1 發酵時間對酶活性的影響Fig.1 Effect of fermentation time on enzyme activity

由圖1可知，發酵時間在12～48 h的范圍內，納豆激酶活性先增加后減少，在36 h時，酶活力達到最大值。36 h之后，酶活力開始降低，納豆激酶的產量不會繼續增加，菌種代謝或菜用大豆等外品內部物質的轉化產生酶抑制劑或者納豆激酶會進一步轉化或降解為其他物質，所以導致后期的酶活性降低[20-21]。發酵時間太短，發酵不完全，菜用大豆等外品中的營養物質不能被完全利用。而發酵時間過長，一方面會導致酶活力降低，另一方面，產生的氨味也會更加的明顯，令人不悅。因此，最佳發酵時間為36 h。

2.1.2 發酵溫度對酶活性的影響結果

按照每100 g滅菌蒸熟后的菜用大豆中接種1.150×1011CFU/100 g納豆枯草芽孢桿菌直投式發酵劑，于溫度為35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃條件下恒溫靜置培養36 h，發酵完成后放入4 ℃冰箱中后熟12 h，分別測定納豆激酶活性，結果見圖2。

圖2 發酵溫度對酶活性的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on enzyme activity

由圖2可知，當溫度在35～41 ℃的范圍內，納豆激酶活性呈現先上升后下降的變化趨勢，當發酵溫度為37 ℃時，納豆激酶活性達到最大值，表明納豆菌可以充分地生長繁殖，并且產生的納豆激酶具有較高的活性。在菜用大豆等外品的發酵過程中，溫度對納豆枯草芽孢桿菌的生長以及納豆菌對營養物質的分解利用程度有著一定的影響，并且過低或過高的溫度都不利于納豆菌的生長和納豆激酶活性的增加，因此，最佳發酵溫度為37 ℃。

2.1.3 接種量對酶活性的影響結果

分別向每100 g滅菌蒸熟的菜用大豆中接種0.580×1011CFU、1.150×1011CFU、1.730×1011CFU和2.300×1011CFU直投式發酵劑，放入預設溫度為37 ℃的恒溫培養箱中培養36 h，發酵完成后放入4 ℃冰箱中后熟12 h，分別測定納豆激酶活性，結果見圖3。

圖3 接種量對酶活性的影響Fig.3 Effect of inoculum on enzyme activity

由圖3可知，在本實驗的接種量范圍內，納豆激酶的活性隨接種量的增加先上升后下降，在接種量為1.150×1011CFU/100g時酶活力達到最大。過高過低的接種量都不利于菌種的生長繁殖。當接種量低于1.150×1011CFU/100 g之前，培養基營養豐富，隨著接種量增加，納豆菌開始快速的不斷繁殖，納豆激酶的產量逐漸增加，酶活性也呈增大的趨勢；當接種量＞1.150×1011CFU/100 g時，由于菌體對氧氣及營養物質的競爭加劇，所以其繁殖會受到限制，使酶活性開始下降。因此，最佳接種量為1.150×1011CFU/100 g。

2.1.4 后熟時間對酶活性的影響結果

在滅菌蒸熟后的菜用大豆中按照1.150×1011CFU/100 g的接種量進行接種，放入37 ℃恒溫培養36 h，發酵完成后放入4 ℃冰箱中分別后熟6 h、12 h、18 h、24 h，分別測定納豆激酶活性，結果見圖4。

由圖4可知，納豆激酶活性隨著后熟時間的延長呈現先增大后降低的趨勢，在后熟時間為12 h時達到最大。而當納豆的后熟時間超過12 h，酶活力開始降低。對于發酵食品來說，這可能是由于納豆激酶隨著后熟時間的延長而進行轉化或是開始降解，也可能由于在后熟過程中會產生特殊的活性物質對其有一定的抑制作用，并且隨后熟時間的不斷延長，這種物質會繼續增加，導致納豆激酶活性逐漸降低。因此，最佳后熟時間為12 h。

2.2 納豆發酵條件優化正交試驗

根據單因素試驗結果，選取對納豆激酶活性有主要影響的3個因素按照3因素3水平進行正交試驗，按照L9（33）正交試驗設計，以納豆激酶的酶活性作為評價指標，正交試驗結果與分析見表2。

表2 納豆發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of natto

由表2可知，納豆最佳發酵條件：接種量為1.150×1011CFU/100 g菜用大豆，發酵溫度37 ℃，發酵時間36 h，后熟時間18 h。

2.3 納豆激酶的分離純化

2.3.1 硫酸銨鹽析結果

向納豆粗酶提取液中緩慢加入研磨后的硫酸銨固體粉末，分別使硫酸銨的飽和度達到20%、40%、60%和80%。將離心后所得沉淀復溶并透析24 h，分別測定各組中所含有的納豆激酶活性大小以及蛋白質的含量，結果見圖5。

圖5 不同飽和度硫酸銨對納豆激酶活性的影響Fig.5 Effect of different saturation ammonium sulfate on nattokinase activity

由圖5可知，當硫酸銨的飽和度為20%時，沉淀出的蛋白質中基本沒有纖溶酶活性，大多數為雜蛋白質；而加入60%飽和度的硫酸銨后，納豆激酶的總酶活力達到最大；飽和度超過60%時，總酶活開始下降，蛋白質含量一直處于增多的趨勢。因此，本實驗后續選取使用20%飽和度的硫酸銨沉淀雜蛋白，再向上清液中繼續加入硫酸銨，使其最終飽和度達到60%沉淀納豆激酶，以此來實現初步分離納豆激酶的目的。

2.3.2 DEAE陰離子交換柱純化納豆激酶

將60%飽和硫酸銨沉淀的納豆激酶經DEAE離子交換層析，結果見圖6。

圖6 DEAE離子交換層析純化納豆激酶Fig.6 DEAE ion exchange chromatogram of purified of nattokinase

由圖6可知，樣品溶液在經過DEAE離子交換柱層析時，會在280 nm波長下產生兩個明顯的吸收峰。對收集管中的納豆激酶液進行活性檢測，結果發現在第39～75 min之間出現的峰組分具有明顯的纖溶活性，所以保留此段時間內的洗脫液，進行真空冷凍干燥，保存于-20 ℃備用。

2.3.3 SDS-PAGE電泳檢測結果

納豆激酶采用SDS-PAGE垂直板電泳法，比較各步分離純化效果，并測定納豆激酶的分子質量，結果見圖7。

圖7 純化納豆激酶SDS-PAGE電泳圖Fig.7 Electrophoresis of SDS-PAGE of purified nattokinase

由圖7可知，納豆激酶經過硫酸銨分段鹽析之后，在電泳的泳道中仍會存在較多的條帶（泳道2），而在經過DEAE離子交換層析之后的樣品泳道，雜蛋白條帶減少，條帶的位置處于25～35 kDa之間（泳道1），與相關文獻[13，22]中報道的納豆激酶的分子質量相近，目前仍然沒有獲得單一組分達到電泳純，有待后續進一步的分離。

2.3.4 納豆激酶分離純化效果評價

在純化納豆激酶的整個過程中，需要對純化過程中的每一步收集的樣品酶液中納豆激酶的活性進行測定，計算出各步的酶比活力、總酶活力、純化倍數和回收率，結果見表3。

表3 納豆激酶的分離純化結果Table 3 Results of nattokinase isolation and purification

由表3可知，發酵液經離心除菌、硫酸銨分段鹽析、離子交換層析等純化步驟后，由于大部分雜蛋白被除去，所以會出現總蛋白呈逐漸降低、而比活力和純化倍數逐漸增高的趨勢；在純化的過程中，酶活力會有一定程度上的損失，這會導致總酶活力的下降。最終經DEAE離子交換層析之后的純化結果為：純化倍數16.3倍，回收率22.5%，比活力達到3 578.3 IU/mg。JU S等[2]研究表明，枯草芽孢桿菌亞種納豆（Bacillus subtilissubsp.natto）WTC016發酵產納豆激酶最佳時間為26 h，酶活力為（3 284±58）IU/mL。這些差異性可能與納豆芽孢桿菌的種類、發酵溫度等因素有關。

2.4 納豆激酶的酶學性質研究

2.4.1 納豆激酶的最適溫度及熱穩定性

圖8 納豆激酶的最適反應溫度（A）及熱穩定性（B）Fig.8 Optimum reaction temperature (A) and thermal stability (B) of nattokinase

由圖8A可知，納豆激酶的最適反應溫度為37 ℃，在該溫度條件下酶活力達到最大。由圖8B可知，溫度在30～40 ℃范圍內，其相對酶活都保持在80%左右，為其最適作用溫度范圍。超過最適溫度之后，溫度繼續升高，酶活性則開始迅速下降。隨著溫度的升高，納豆激酶的穩定性下降。在30 ℃、40 ℃條件下熱處理60 min后，其酶活性依然達到原酶活性70%以上；而在50 ℃條件下熱處理60 min后，其酶活性僅達到原酶活性的38%左右；在60 ℃條件下熱處理20 min后其酶活性僅達到原酶活性的27%，熱處理60 min后，酶活性幾乎完全喪失。因此，納豆激酶在低于40 ℃時較穩定。

2.4.2 納豆激酶的最適pH值及pH值穩定性結果

由圖9A可知，納豆激酶的最適pH值為8.0，pH值偏高或是偏低，會對納豆激酶的活性產生一定的影響。由圖9B可知，納豆激酶在不同pH值條件下反應1 h后，當pH值在6.0～8.0 范圍比較穩定，其酶活力可達原酶活力的60%以上。在pH值＞8及pH值＜6時，納豆激酶穩定性較差，納豆激酶的活力迅速下降。

圖9 納豆激酶的最適反應pH值（A）及pH值穩定性（B）Fig.9 Optimum reaction pH (A) and pH stability (B) of nattokinase

2.4.3 納豆激酶體外溶栓效果

納豆激酶體外血凝塊的溶解作用見表8。由表8可知，隨著反應時間的延長，納豆激酶對血塊的溶解率呈不斷上升的趨勢；在相同時間內，納豆激酶的溶栓效果隨濃度的增加而增高，且與對照組相比均有顯著差異（P＜0.05）。在反應時間為5 h、納豆激酶質量濃度為10 mg/mL時，該酶對血凝塊的溶解率比對照組高38.40%；在納豆激酶質量體濃度為20 mg/mL時，該酶對血凝塊的溶解率比對照組高49.03%；隨著反應時間的延長或者酶濃度的提高，該酶體外血凝塊的溶解率都明顯上升，結果表明納豆菌發酵菜用大豆等外品產生的納豆激酶具有明顯的體外溶栓作用。

表4 納豆激酶的體外溶栓作用Table 4 Thromobolytic effects of nattokinase in vitro

3 結論

本實驗利用納豆菌發酵菜用大豆等外品生產納豆，以納豆激酶活性作為標準，確定了納豆的最佳發酵條件，并對納豆激酶進行了初步分離純化和部分性質的研究。在此條件下，發酵納豆中的納豆激酶活力可達2 326.60 IU/g。分別采用20%飽和度和60%的飽和度硫酸銨沉淀雜蛋白質和納豆激酶，再經過DEAE陰離子交換層析對其進一步的分離純化，最終得到酶的分子質量介于25～35 kDa之間，酶純化倍數為16.3倍，回收率為22.5%，比活力為3 578.3 IU/mg。納豆激酶的最適作用pH值及溫度分別為37 ℃、8.0，當溫度低于40 ℃及pH值在6.0～8.0的范圍內較穩定；在體外的溶栓作用結果表明：加入酶液組的溶解率與對照組相比均有顯著差異（P＜0.05），說明納豆菌發酵菜用大豆等外品產生的納豆激酶具有良好的體外溶栓作用。