棒狀鏈霉菌F613-1的誘變及其發酵工藝優化

劉永青

（呂梁學院生命科學系，山西離石 033000）

克拉維酸（clavulanic acid，CA）又名棒酸，有微弱的抗菌活性，是一種β內酰胺酶抑制劑，C2位上有一個β羥基乙叉取代基，而C6位沒有酰氧基。它以氧原子取代了青霉素及頭孢菌素惡唑環中的硫原子，形成3R、5R立體結構[1]，目前主要與各種β內酰胺類抗生素聯合使用以解決細菌耐藥性問題[2]。

棒狀鏈霉菌是克拉維酸的生產菌株，屬于放線桿菌家族，是一種產β內酰胺類抗生素的需氧革蘭氏陽性菌。通過基因工程手段對菌株理論研究的較多，如LI J等[3-5]通過解析工業菌株F613-1基因組信息來破譯其高產機理；左志晗等[6]在棒狀鏈霉菌NRRL3585基礎上構建了lat基因阻斷的突變菌株；áLVAREZ-áLVAREZ R等[7]通過構建oppA2缺失突變體研究克拉維酸生產通路。基于誘變技術篩選高產菌株的研究主要集中在通過紫外、亞硝基胍（nitroso-guanidin，NTG）和甲基磺酸乙酯（ethylmethane，EMS）誘變，內酰胺酶、鏈霉素、甘油耐受和舒巴坦鈉篩選培育高產菌株[8-12]。

作為克拉維酸合成途徑的前體物質，添加精氨酸理論上可以使克拉維酸合成增加，但目前研究結果不一致[13-15]，可能與菌株、精氨酸濃度有關。研究表明，添加鳥氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和賴氨酸都有利于克拉維酸合成[14，16]，覃榮活等[17]研究表明，谷氨酸鹽到精氨酸代謝途徑的基因整體表達上調，有利于克拉維酸合成。谷氨酸是多種氨基酸的代謝前體，在氨基酸代謝中處于核心位置，且成本較低，故本實驗采用谷氨酸作為克拉維酸前體添加劑。

甘油衍生物3-磷酸甘油是克拉維酸合成的限速因素[18-19]，所以工業生產中常把甘油作為添加前體。本試驗以工業生產菌棒狀鏈霉菌F613-1為出發菌株，經過紫外和NTG聯合誘變處理，篩選高產菌株進行遺傳標記鑒定。以甘油為碳源添加劑，分別考察添加不同氮源前體——精氨酸和谷氨酸時菌株的培養效果。在對高產菌株發酵研究基礎上，利用響應面法優化菌株發酵條件，為進一步提高克拉維酸生產、降低成本提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棒狀鏈霉菌（Streptomyces clavulans）F613-1：由山東省醫藥生物技術研究中心贈送；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）相關酶、引物和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：北京博凌科為生物科技有限公司；液相試劑均為國產色譜級，其余試劑均為國產分析純。

固體培養基[17]：0.4%葡萄糖，0.3%胰蛋白胨，1.5%麥芽提取物，2%瓊脂粉，pH調至7.5；

種子培養基：2%大豆超細粉，1.2%玉米淀粉，0.5%酵母膏，0.08%磷酸氫二鉀，1.1%三油酸甘油酯，pH 8.0；

發酵培養基：3.0%大豆超細粉，2%大豆蛋白提取物，3.0%麥芽糊精，1.5%三油酸甘油酯，0.1%氯化鉀，0.25%磷酸氫二鉀，0.1%氯化鎂，0.05%氯化鈣，0.01%三氯化鐵，0.02%氯化鈉，0.05%泡沫劑，pH 7.0。

所有培養基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SC-04離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國安捷倫公司；2720 PCR儀：美國ABI公司；DYY-10C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；HZQ-X700C恒溫振蕩培養箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

固體培養：棒狀鏈霉菌F613-1孢子在固體培養基上25 ℃培養10 d[17]。

種子培養：按106個/mL接種孢子于種子培養基，25 ℃、250 r/min振蕩培養48 h。

發酵培養：以10%（V/V）的接種量將種子液接入發酵培養基，25 ℃、300 r/min振蕩培養144 h，250 mL燒瓶裝液量為50 mL。

1.3.2 誘變篩選方法

收集棒狀鏈霉菌孢子制備單孢子懸液（孢子濃度約為107～108個/mL）。距30 W紫外燈30 cm處照射4 min，然后用6 mg/L的NTG處理40 min，將誘變后的孢子懸液涂布于含60 μg/mL鏈霉素[20]的固體培養平板上，25 ℃培養10 d。取各單菌落涂平板，25 ℃培養5 d，測定克拉維酸含量。取克拉維酸含量最高的菌落繼續復合誘變3次，按上述方法篩選突變株。

1.3.3 遺傳標記擴增

將出發菌株F613-1和突變株在種子培養基中25 ℃培養60 h，3 000×g離心收集細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌。使用DNA試劑盒提取基因組DNA，根據GenBank序列代碼AY426768（pah1）和X84101.1（Cas2）進行PCR引物設計以驗證遺傳標記[21]。pah1上游引物（P1）5'-GCAGCCATATGTCCACCGCCGTCTCCCCGCGCTACGCCCAAC-3'，pah1下游引物（P2）5'-GTGGTGCTCGAGCTACCCCCACCGCTGCCCGGCGAAGTCCAC-3'；Cas2上游引物（C1）5'-GCGCCATATGGCCTCTCCGATAGTTGACTGCACCC-3'，Cas2下游引物（C2）5'-GACTCGAGTCAGCGGCGCGGCGAGAACG-3'。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min，然后94 ℃、30 s，65 ℃、1 min，72 ℃、3 min，35個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.4 不同培養基突變株發酵研究

將甘油添加量調至1.5%，比較分別添加0.15%谷氨酸[22]和0.15%精氨酸對克拉維酸生產的影響，試驗在25 ℃、300 r/min、250 mL燒瓶中進行，發酵時間為144 h，每隔12 h收集并測定培養物。

1.3.5 突變株發酵條件的優化

以突變株為發酵菌株，在發酵培養基基礎上，實行二段法發酵。全程300 r/min振蕩培養，36 h之前按25 ℃、pH7進行，36 h后分別設置發酵溫度（25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、37 ℃）、pH值（5.5、6、6.5、7、7.5、8）和發酵時間（60 h、72 h、80 h、96 h、108 h、120 h）為單一變量，進行發酵試驗。在單因素試驗的基礎上，按照響應曲面Box-Behnken法，優化克拉維酸發酵條件。為保證結果的可信度，每次試驗平行3次，符合統計學分析的結果按平均值計算。

1.3.6 測定方法

克拉維酸檢測：誘變菌固體平板培養采用生物效價法[23]；液體發酵采用高效液相色譜（HPLC）法[17]。細胞生物量測定：樣品3 000×g離心，收集細胞，雙蒸水洗滌細胞兩次，65 ℃孵化至恒質量。甘油濃度：參照Eliton的方法測定[24]。谷氨酸、精氨酸濃度：參照2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB）衍生法測定[25]。

2 結果與分析

2.1 突變菌株篩選

經過紫外和NTG復合處理3次，篩選到1株效價最高的突變菌株。25 ℃、300 r/min振蕩培養96 h，可達4.19 g/L，比出發菌株提高19.9%。將該菌株平板傳代3次，遺傳穩定性良好。

2.2 遺傳標記鑒定

以菌株F613-1為對照，對突變株的2個克拉維酸相關基因進行PCR擴增，以驗證突變株是否為棒狀鏈霉菌的衍生菌株，棒狀鏈霉菌F613-1和突變株的PCR擴增圖譜見圖1。

由圖1可知，第2和第4泳道為菌株F613和突變株的pah1基因擴增產物，長度均在1 056 bp左右；第3和第5泳道為菌株F613和突變株的cas2基因擴增產物，長度均在978 bp左右。棒狀鏈霉菌F613-1和突變株的PCR擴增圖譜相同，說明該突變株為棒狀鏈霉菌變種。

2.3 突變株克拉維酸生產研究

精氨酸和3-磷酸甘油是克拉維酸合成的直接前體物質，由于成本限制，發酵時谷氨酸替代精氨酸添加已成為克拉維酸生產的趨勢。因此在添加1.5%甘油基礎上，考察谷氨酸和精氨酸對突變株克拉維酸生成的影響，結果見圖2。

由圖2可知，谷氨酸替代精氨酸對突變株克拉維酸生產影響不大；添加谷氨酸可提高突變株克拉維酸產量，同時克拉維酸累積至最大值所需時間提前至72 h。谷氨酸在72 h消耗殆盡，72 h以后突變株克拉維酸產量降低可能與之有關。36～72 h之間添加甘油和谷氨酸突變株無論生物量還是克拉維酸產量都較對照有較大提高，可能與突變株攝取營養物質能力提高且發酵液中谷氨酸相對充足有關，后續實驗將谷氨酸添加量控制在0.15%。

為了將甘油和谷氨酸最大限度應用于克拉維酸合成，發酵初始添加0.1%谷氨酸和0.5%甘油，發酵36 h添加0.05%谷氨酸和1%甘油，突變株實行二段法發酵，36 h之前以菌種生長為主，36 h后以產克拉維酸為主，通過響應面試驗優化發酵條件。

2.4 突變株發酵條件的優化

2.4.1 發酵溫度對克拉維酸產量的影響

圖3 發酵溫度對克拉維酸產量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on clavulanic acid yield

由圖3可知，隨著發酵溫度在25～37 ℃范圍內的升高，克拉維酸產量呈先升高后降低的趨勢，當發酵溫度28～32℃范圍內克拉維酸產量較高，可能是菌體合成克拉維酸相關酶在該溫度內活性較高；發酵溫度為30 ℃時，克拉維酸產量達到最高，為4.10 g/L；當發酵溫度高于32 ℃，克拉維酸產量持續降低，可能是克拉維酸合成受到抑制且降解增強的結果。故選擇發酵溫度28～32 ℃進行后續研究。

2.4.2 pH對克拉維酸產量的影響

圖4 pH值對克拉維酸產量的影響Fig.4 Effect of pH value on clavulanic acid yield

由圖4可知，隨著pH升高，克拉維酸產量呈先升高后降低的趨勢，當pH 6.5～7.5范圍內克拉維酸產量較高，可能是克拉維酸合成增加且降解被抑制的結果；pH為7時克拉維酸產量達到最大值，為3.41 g/L；當pH＞7.5之后，克拉維酸產量持續降低，可能高pH時克拉維酸降解速率增大所致。故選擇pH 6.5～7.5進行后續研究。

2.4.3 發酵時間對克拉維酸產量的影響

圖5 發酵時間對克拉維酸產量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on clavulanic acid yield

由圖5可知，隨著發酵時間在60～120 h范圍內延長，克拉維酸產量呈先升高后降低的趨勢，在發酵時間72～96 h范圍內克拉維酸產量較高，可能是發酵液營養相對充足且代謝副產物較少的結果；發酵時間為72 h時克拉維酸產量達到最大值，為4.72 g/L；當發酵時間＞72 h之后，克拉維酸產量持續降低，可能與發酵液中代謝副產物增多有關。故選擇72～96 h進行后續研究。

2.4.4 突變株發酵條件優化的響應面試驗

根據單因素試驗結果，選擇克拉維酸產量（Y）為響應值，發酵溫度（A）、pH值（B）及發酵時間（C）為考察因素進行3因素3水平的響應面試驗。響應面試驗結果見表1，回歸模型顯著性檢驗見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對數據進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：Y=5.26+0.10A+0.39B-0.28C+0.025AB+0.065AC+0.11BC-0.21A2-0.77B2-0.10C2

根據表2可知，整體數學模型P＜0.000 1，失擬項P＞0.05，表明該方程對試驗擬合性好，可以用該模型來分析和預測克拉維酸發酵工藝。方差分析結果顯示模型中A、B、C、BC、A2、B2、C2差異顯著，表明各因素對克拉維酸產量的影響不是簡單的線性關系。根據回歸分析結果做圖得響應曲面圖6。

表1 突變株發酵條件優化響應面試驗設計與結果Table 1 Design and results of response surface methodology for fermentation conditions optimization of the mutant strain

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of the regression model

圖6 發酵溫度、pH值、發酵時間交互作用對克拉維酸產量影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,pH and fermentation time on clavulanic acid yield

由圖6可知，克拉維酸產量隨pH值的增加變化幅度較大，發酵時間次之，發酵溫度影響較小，且pH值與發酵時間交互作用顯著。綜合上述分析結果，軟件Design-Export8.0.6確定的最佳提取工藝條件為發酵溫度28.94 ℃，pH值7.02，發酵時間73.32 h，克拉維酸產量理論值達到5.46 g/L。實際操作過程中將發酵條件修正為發酵溫度29℃，pH值7，發酵時間73 h，平行3次試驗，克拉維酸產量實際值為5.44 g/L，絕對誤差為0.36%，說明試驗結果與理論預測契合度良好。

3 結論

本試驗在工業菌株棒狀鏈霉菌F613-1基礎上獲得一株高產菌，克拉維酸產量較出發菌株提高19.9%；添加1.5%甘油和0.15%谷氨酸可大縮短低突變株發酵時間；突變株前36 h時25 ℃培養，后37 h時29 ℃培養，發酵pH值為7，克拉維酸產量達5.44 g/L，較出發菌株F613-1提高了55.8%。為下一步優化發酵罐生產提供理論基礎。