血流感染的實驗室診斷技術進展

郭鷹 江代紅 郭富饒

重慶市巴南區人民醫院檢驗科（重慶401320）

血流感染是由病原微生物侵入血液而導致的嚴重疾病，會造成血流障礙、器官衰竭甚至死亡，給社會帶來了沉重負擔［1］。近年來，發病率持續增加，全世界每年大約有3 000 萬人罹患這一疾病。據統計，在美國，血流感染導致的死亡占醫院死亡總數的1/3～1/2 之多［2］。高病死率的主要原因就在于疾病發生早期不能進行有效的抗生素治療，目前臨床采用的經驗性廣譜抗生素治療不僅會利于耐藥病原體的選擇和傳播，也會增加真菌感染的風險，同時還造成醫療資源的浪費［3-5］。

血流感染快速、明確診斷，病原微生物識別及藥敏性分析是及時實行針對性抗生素治療的前提，對于改善患者預后尤為重要。血培養作為血流感染診斷的金標準，其作用及價值早已被證實。但耗時耗力，且陽性率較低，難以實現快速診斷［6］。進入21 世紀后，分子生物學迅速發展，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術，基于核酸的技術（DNA 分子雜交和快速PCR 檢測）等的出現徹底改變了傳統微生物鑒定方法，大大縮短了所需的時間［7］。隨著分子技術的不斷進展，使得直接從血液樣本中鑒別微生物甚至分析其藥物敏感性成為可能。盡管用于血流感染的快速診斷新技術仍處于發展階段，其臨床應用潛力不容小覷，可為血培養提供補充或替代選擇，在不久的將來或可完全替代傳統方法，從而更好地服務臨床。

本文分析了血培養技術的發展現狀，總結用于血流感染樣本的快速診斷技術最新進展，討論這些技術的臨床應用前景和面臨的挑戰，以期為提高和加快血流感染診斷和治療提供新的思路。

1 “金標準”血培養

血培養是診斷血流感染的金標準。臨床上高度懷疑血流感染的發熱患者，需要通過血培養來進一步識別致病微生物及其藥物敏感性，指導臨床治療。血培養一直被廣泛應用，但整個過程耗時耗力，至少需要3～5 d 才能獲得結果［8］。連續監測血液培養系統（CMBCS）的引入，使得大多數微生物，可在24 h 內獲得陽性結果，加快了診斷進程。但依據目前的培養流程，在培養陽性后仍需要48 h 才能獲得微生物鑒定（ID）及藥物敏感（AST）結果［9］。傳統血培養方法耗時太多，顯然需要一種更好的方法，來實現快速診斷。

2 從陽性血培養物鑒定病原微生物的分子技術

目前的血培養方法需要將陽性培養物再次接種，過夜培養形成菌落克隆，再進行ID 和AST 檢測。將陽性血培養物直接用來檢測可以較當前方法提前12 ～24 h 獲得結果。

2.1 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）MALDI-TOF MS 是應用在微生物鑒定中最廣泛的質譜方法，具有方便、快速、準確的優勢。通過測定蛋白、核酸質譜，與參考數據庫中的質譜進行比較來鑒定微生物。最初，這種方法僅應用于培養基上的細菌菌落。但隨著研究的進展，該技術已被用于直接從陽性血培養瓶中鑒定病原微生物，增加了它的實用性［10］。MALDI-TOF MS 被認為是極具前景的快速診斷技術，對不同種類微生物的陽性預測值可以達到60% ～80%［11］?，F在已經有比較成熟的商業試劑盒，如Sepsityper?kit（Bruker Daltonics）和VITEK?MS blood culture kit（bioMérieux）［12］。已有文獻報道基于MALDI-TOF MS 的自動、同時多相基因檢測系統已被研發出來用于快速識別病原微生物及其耐藥基因。利用MALDI-TOF MS 快速鑒定病原微生物已經被許多機構整合為常規測試，然而，目前尚無標準化的臨床前處理方法，檢測結果存在較大差異。另外，該方法不能適用于多重病原體感染的診斷［13］。

2.2 PCR 檢測技術微生物核酸被提取、純化和PCR 擴增，隨后可通過高分辨率熔融曲線分析、微陣列雜交、凝膠電泳、序列分析或者實時定量PCR來快速診斷多種病原體感染［14］。另外，還可通過對16S 和（或）23S rRNA 的DNA 序列進行實時PCR擴增，然后進行焦磷酸測序以完成鑒定。研究表明，該方法與血培養結果的一致性達98.9%，敏感性為90.9%，特異性為99.6%［15］。在AST 檢測方面，PCR 技術被用于檢測甲氧西林、萬古霉素耐藥基因，對藥物使用、患者療效和成本效益具有積極的作用［16］?？偟膩碚f，基于PCR 的技術相對于傳統血培養的主要優勢包括更快的周轉時間和在抗菌治療期間更高的檢出率［17］。但該技術也有著明顯的缺陷，PCR 技術檢測微生物種類有限。并且，這項技術成本較高，需要專業人員進行操作［18］。

2.3 肽核酸熒光原位雜交技術（PNA-FISH）PNA熒光原位雜交技術是一項最新的分子診斷技術，只需要1.5～3 h就可以從陽性血培養物中檢測鑒定病原微生物［19］。PNA探針具有肽鏈骨架，與DNA 分子結合后，可以通過堿基互補配對原則高度特異地與細菌16S rRNA 及酵母18S rRNA 雜交。通過設計特殊的探針，包括葡萄球菌探針、腸球菌探針、革蘭陰性菌探針、酵母探針等，可以快速識別血流感染患者陽性血樣中的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和假絲酵母菌。在一項研究中［20］，作者用PNA熒光原位雜交技術快速鑒別光滑念珠菌（Cgl）和白色念珠菌（Cal），及時調整治療方案，減少了不必要的棘球白素的使用。這一技術對于細菌和真菌都具有高度的特異性和敏感性，且快速、簡單，易于整合到當前的診斷流程中，極具臨床應用前景。當然，該技術還需要進一步研究以解決其技術缺陷，包括檢出限不低于105CFU/mL、探針數量極其有限且目前不具備檢測耐藥基因的能力。

2.4 單細胞拉曼光譜技術拉曼光譜可在單細胞水平上對單核細胞和真核細胞進行拉曼光譜的檢測，生成其唯一的生物分子“指紋光譜”，用來識別病原微生物。拉曼光譜具有快速、靈敏、無標記、無創、受水干擾小等特點，在多種病原微生物感染的診斷中也有著獨特優勢，并且拉曼光譜技術可用于識別耐藥細菌。

中科院蘇州醫工所聯合團隊基于Raman-DIP原理，開發了一種快速藥敏方法，可在21 h 內給出血樣的藥敏結果［21］。血培養陽性的樣本加入到藥敏板作用后再加入重水，易感菌代謝活動被抑制，拉曼圖譜呈現C-H 峰，而耐藥菌出現偏移的C-D峰。這種藥敏分析是基于抗生素對細菌作用的表型，因此結果不會因未知的耐藥機制或基因表達調控而產生對藥敏的誤判。

3 直接從血液中鑒定病原微生物的分子技術

治療血流感染的關鍵就在于早期抗生素的使用，臨床診斷后3 h 內開始治療，可以顯著降低患者病死率［22］。然而，研究表明，早期不合理的抗生素治療會縮短患者的生存期［23］。因此，在疾病發生最初1～3 h 內快速完成實驗室診斷十分必要。傳統血培養鑒定受到培養陽性報警時間的限制，而直接從血液樣本中快速檢測則更具吸引力，可以將診斷時間縮短至數小時甚至數分鐘內。

3.1 PCR-電噴霧電離質譜（PCR/ESI MS）PCR技術和ESI MS 技術結合可以用來直接識別血液樣本中的病原微生物，完美結合了PCR 的高靈敏度和質譜的高準確度。運用該技術的IRIDICA 平臺已經被開發商業化，可以在6 h 內，鑒定出常見的780 種細菌和念珠菌，但能識別的耐藥基因只有四種（mecA、vanA、vanB 和blaKPC）［14，24］。首先從5 mL 全血樣本中自動提取DNA，加入不同引物，通過PCR 分別擴增細菌和念珠菌的rRNA 基因，ESI MS技術測得擴增產物分子量，與數據庫進行對比來鑒定微生物。這些引物和反應成分經過優化以減少人類DNA的干擾，提高擴增效率。METZGAR等［25］發現，PCR/ESI MS 與傳統血培養的一致性達80%，并在46 例血培養陰性樣本中檢測到了病原微生物，有著更高的靈敏度。不過，該技術檢測耐藥基因的能力有限，還需要常規血培養后再進行AST。目前或可作為傳統方法的補充手段，但不能完全替代。

3.2 液滴數字檢測技術一種被稱為“集成綜合液滴數字檢測”（IC 3D）的新興技術聲稱可以在1～4 h 內直接從少量全血中選擇性地檢測單個細菌，不需要培養增殖，也不需要基因擴增。IC 3D將基于DNA 酶的傳感器與實時液滴微膠囊和粒子計數器結合。首先，直接將血液樣本分成數十億含細菌及DNA 傳感器的微米級液滴。傳感器與細菌靶序列結合后產生熒光信號，達到識別鑒定細菌的目的。液滴技術可以很大程度地減少血樣中其他物質的干擾，避免了分離純化等繁瑣步驟。在一項研究［26］中，作者用該技術檢測大腸桿菌污染的血樣，對于每毫升僅含一個細菌的樣本，用時3.5 h，陽性率77%。該技術真正實現了簡單、快速、單細胞靈敏度，不過目前該系統每次只能檢測特定單一菌種，并且受限于熒光通道數量，可拓展能力差。

3.3 T2 磁共振T2 磁共振是一種小型化、基于磁共振的診斷技術，可在磁場存在時測量水質子T2弛豫信號變化。該方法包括PCR 擴增病原微生物特異性DNA 序列，然后將產物與超順磁納米粒子修飾探針雜交。雜交會導致納米顆粒聚集，出現可檢測到的變化，從而確定微生物的存在。T2 磁共振可以在不到5 h 內檢測出復雜樣本中含量極少的目標核酸［27］?？茖W家用T2 磁共振檢測五種常見病原微生物（ESKAPE，E.faecium、S.aureus、K.peneumoniae、A.baumanii、P.aeruginosa、ENT），并與傳統的血培養方法進行了比較。該技術的敏感性和特異性均為90%，血培養陰性而磁共振陽性的樣本占10%。平均花費時間為3.6～7.7 h［28］。不過，該方法不能提供微生物的耐藥信息，且費用昂貴。未來的研究需要評估這些局限性是否可以克服，并進一步驗證這種方法在其他種類病原微生物檢測中的應用。

3.4 微流控技術血液中病原微生物的濃度遠低于紅細胞、白細胞、血小板等，有效分離是診斷的關鍵步驟。在一項研究中，作者用集成的微流控芯片技術快速分離血液中的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。該技術包括一個膜過濾模塊、細菌捕獲模塊和PCR 擴增模塊。通過膜過濾分離血漿，再用甘露糖結合凝集素修飾的磁珠捕獲細菌，最后實時熒光定量PCR 識別細菌。濾過膜可以去除所有的白細胞和99.5%的紅細胞，細菌捕獲率接近85%，PCR 檢出限為每個反應5 CFU，整個過程只需4 h［29］。與血培養方法相比，該技術可以在更短的時間內檢測出血液樣本中低濃度的病原微生物，更大程度地發揮PCR 技術的優勢［30］。當然，該技術還需要進一步的臨床研究來證明其價值。

另外，微流控技術也可以與生物芯片技術結合，將微生物的收集、培養、擴增以及識別鑒定在復雜體系內一步完成。生物芯片技術是將生物大分子固定于固相介質上形成分子點陣，樣品與探針分子發生相互作用后信號被采集分析。生物芯片可以分為基因芯片和蛋白質芯片，具有高通量、微型化和平行分析的特點，在微生物鑒定及耐藥基因分析中發揮越來越重要的作用。

4 結論

血流感染診斷的理想標準是3 h 內快速識別細菌、真菌、病毒等微生物及其藥敏性，以便及時選擇有效的抗生素進行治療，改善患者預后。分子技術的發展，使得快速診斷更趨向于理想標準。不過，每種技術都有其獨特的優勢和缺陷。這就需要不同技術聯合使用以及不同領域之間的協調合作，科學家研究開發新的技術，臨床醫生綜合考量臨床指標和實驗室指標［31］，實驗室工作人員掌握并積極使用新的檢測方法，工程師制造自動化檢測設備，行業內制定相關的標準流程。總之，各種新興分子技術有足夠潛力實現血流感染的快速診斷，但目前仍需作為血培養的輔助手段，不斷在臨床上進行驗證以獲取更多的數據，為日后替代傳統方法提供依據。