FGL-1作為LAG-3主要的免疫抑制配體在惡性腫瘤中的研究進展

賈王強 倪紅諺 袁龍

鄭州大學附屬腫瘤醫院（鄭州450008）

癌癥在全世界的病死率和發病率仍然居高不下，每年新增患者1 810 萬例，僅2018年因癌癥死亡人數達960 萬［1］。目前癌癥治療方法主要包括手術、化療、放療、免疫治療以及它們的組合療法，而免疫治療被學術界廣泛認為是治療各種癌癥最重要的研究成果之一［2］。腫瘤特異性T 細胞在腫瘤進展期間獲得的多種抑制性受體的表達可導致其功能失調，而免疫治療作用于這些抑制性受體以逆轉其功能失調，并阻斷抗腫瘤免疫反應中抑制T 細胞的途徑，重新激活腫瘤特異性T細胞應答反應以促進腫瘤消除［3］。免疫檢查點（immune checkpoint）是負向調節T 細胞功能的抑制信號分子，能夠抑制細胞毒性T 淋巴細胞（CTL）在腫瘤中殺傷癌細胞的能力［2，4］。盡管免疫檢查點治療在臨床中取得了重大突破，但腫瘤內在抗性導致在實體腫瘤中大量使用免疫檢查點抑制劑的反應率很低［2，5］。為了讓更多患者從免疫治療中受益，免疫治療的重點已轉向針對腫瘤微環境中的新型替代免疫檢查點［6］，例如淋巴細胞活化基因-3（LAG-3）及其配體纖維介素蛋白-1（fibrinogen like protein 1，FGL-1）等。

LAG3 是一種免疫檢查點受體蛋白，主要表達在活化的T 淋巴細胞上［7］。研究表明，主要組織相容性復合物Ⅱ類（MHC-Ⅱ）作為LAG-3的經典配體，LAG-3 與MHC-Ⅱ分子的結合可以下調T 細胞的活性。然而，MHC-Ⅱ是否僅對LAG-3 有抑制功能仍是不清楚的。同時，LAG-3 也可增強調節性T 細胞（Tregs）的抑制活性，通過治療性抗體抑制LAG-3，可解除LAG-3 對T 細胞的抑制作用，增強機體免疫應答［8-9］。纖維介素蛋白-1 是一種肝細胞分泌蛋白，屬于纖維蛋白原家族。在正常生理條件下，FGL-1蛋白主要由肝細胞分泌并促進其有絲分裂和代謝功能［10-11］。最近有研究顯示FGL-1 是LAG-3的一個重要的功能性配體，并揭示了LAG-3-FGL-1通路在腫瘤免疫中的作用［12］。FGL-1 作為LAG-3的配體，其在體外和體內以受體-配體相互依賴的方式發揮其對T 細胞的抑制功能。阻斷FGL-1-LAG-3 相互作用可以刺激腫瘤微環境中T 細胞的活化和增殖以提高機體對腫瘤的免疫與清除能力。癌癥患者血漿中FGL-1升高與預后不良和免疫治療效果有關［13］。雖然有一些研究對LAG-3 腫瘤免疫中的作用進行了研究，但對于LAG-3-FGL-1通路在腫瘤免疫中的作用及可能的機制相關研究較少。本文旨在總結腫瘤患者與FGL-1 的關系，以及總結FGL-1 蛋白的生物學特征，揭示其可能的免疫學機制，期望能為腫瘤免疫治療提供新的思路。

1 LAG-3 的結構及功能

LAG-3 是在活化的T 細胞上被發現的含有498個氨基酸的跨膜蛋白，由胞外區、跨膜區和胞質區3 個部分組成［7-8］。該蛋白的編碼區位于人12 號染色體短臂的遠端部分，與CD4 的編碼區相鄰。TRIEBEL 等［14］對LAG-3 的氨基酸序列的分析顯示，其具有4 個與CD4 高度同源的細胞外IgSF 域（D1～D4），而D1 的親和力高于CD4，因此其可以通過干擾MHC-Ⅱ與CD4 的結合來抑制T 細胞活化；LAG-3 可與MHC-Ⅱ相互作用以阻止相同的MHC分子與TCR 和CD4 結合，從而直接阻斷免疫反應中的TCR 信號傳導通路。然而有研究［15］發現，LAG-3 不能普遍結合MHC-Ⅱ，而是選擇性地結合穩定的MHC-Ⅱ復合物（peptide-MHC class Ⅱ，pMHC-Ⅱ），并可優先抑制與穩定的pMHC-Ⅱ反應的T 細胞的活化。此外，LAG-3 不會干擾CD4-pMHC-Ⅱ和TCR-pMHC-Ⅱ的相互作用。LAG-3 的IC 區由約60 個氨基酸殘基組成，LAG-3 的抑制功能需要其細胞內的IC 區域參與，這表明LAG-3 會通過其IC 區域轉導抑制信號。LAG-3 細胞質尾部的分子結構與其他免疫檢查點截然不同，它具有3 個結構域：第1 個區域是絲氨酸磷酸化位點；第2 個區域是含有KIEELE 基序的單個賴氨酸殘基，此結構域對調節CD4+T 細胞的功能至關重要；第3 個區域是谷氨酸-脯氨酸重復序列，與LAG-3 相關蛋白（LAG-3 related protein，LAP）結合，有助于定位LAG-3。在這3 個區域中，KIEELE 基序對信號轉導和LAG-3 的抑制功能是不可或缺的［16］。

2 腫瘤及TIL 中的LAG-3

2.1 LAG-3 在腫瘤中的表達與作用LAG-3 在多種惡性腫瘤中異常表達，與腫瘤的發生、發展及預后密切相關。在慢性淋巴細胞性白血病中，LAG-3高表達患者的療效較差［17］。在肝細胞癌中LAG-3的高表達與腫瘤進展密切相關［18］。在胃癌中，LAG-3 在CD4+T 和CD8+T 細胞上的表達升高，可能會損害細胞介導的免疫功能［19］；LAG-3 在黑色素瘤的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）上表達與黑色素瘤的TNM 分期及預后有關［20］；LAG-3 在乳腺癌患者中的表達與其存活率呈正相關，與復發風險呈負相關［21-23］；在卵巢癌中，LAG-3在紐約食管鱗狀細胞癌-1（NY-ESO-1，New York esophageal squamous cell carcinoma-1）誘導的特異性CD8+T 細胞上高表達，使其產生IFN-g 和TNF-a 的能力下降；此外，LAG-3 在肺癌及結直腸癌等惡性腫瘤中均高表達且與疾病預后有一定的關系［23］。

2.2 LAG-3 在TIL 中的表達與作用在腫瘤進展期間，腫瘤浸潤性CD4+T 細胞會慢慢衰竭，LAG-3的表達也會升高［24］。編碼LAG-3 分子與編碼CD4分子基因的染色體定位相同，擁有共同的外顯子和內含子，因此LAG-3 與CD4 可能是同一基因復制進化而來的。TRIEBEL 等［14］發現MHC-Ⅱ類分子是LAG-3 和CD4 的共同配體，LAG-3 與CD4 的同源性表明其可以結合MHC-Ⅱ類分子，LAG-3 通過與MHC-Ⅱ類分子結合并相互作用抑制特異性CD4+T 細胞的增殖。ASCIERTO 等［9］發現，在CD4+T 細胞中的Th1 上可檢測到LAG-3，而在大部分Th2 上不能檢測到，這說明LAG-3 可作為區分Th1和Th2 的表面標志物。然而后來又有研究［25-26］認為，LAG-3 表達可能無法可靠地區分Th1 和Th2。LAG-3 在未活化的CD8+T 細胞表達較少，而當受相應的抗原刺激后，LAG-3 的表達顯著升高。LAG-3在活化的CD8+T 細胞上高水平表達，抑制CD8+T 細胞的活化及增殖，從而抑制CD8+T 細胞的抗腫瘤活性。越來越多的研究發現，LAG-3 可在各種類型腫瘤的腫瘤浸潤性CD8+T 細胞中過度表達，如卵巢癌、肺癌、結直腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌和其他實體腫瘤［23，27］。此外，LAG-3 分子的mRNA 在CD8+T 細胞表面高表達可導致CD8+T 細胞的功能缺陷。LAG-3 也在Treg 中高表達。最近的研究［28］發現，LAG-3 可以促進Treg 分化，而阻斷LAG-3 可以減弱其對Treg 的誘導作用，腫瘤浸潤性Treg 在腫瘤進展過程中與PD-1、CTLA-4、LAG-3 和T 細胞免疫球蛋白粘蛋-3（TIM-3，T-cell immunoglobulin mucin-3）等抑制性分子一起可以增強Foxp3 的積累。有研究發現［29］，LAG-3+Foxp3+Treg 細胞在外周血單個核細胞（包括淋巴細胞和DC 等）、TIL 及黑色素瘤、結直腸癌患者的腫瘤組織中高表達，活化的LAG-3+Treg 能夠產生IL-10 和轉化生長因子-b1（TGF-b1），LAG-3+Treg 細胞具有免疫抑制作用，與腫瘤免疫逃逸相關。LAG-3 潛在的生物學機制最初在活化的NK 細胞上被發現，但LAG-3 對NK 細胞的調控作用在小鼠模型和人細胞模型中的結果并不一致。在小鼠身上的研究發現，敲除LAG-3基因可以導致小鼠NK 細胞自然殺傷活性降低［30］。另有研究發現，LAG-3抗體對人類的NK細胞自然殺傷活性沒有特異性影響，然而其機制尚不清楚［31］。根據最近的研究［32］，LAG-3 在漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）上表達水平比在任何其他DC 亞群上都高。LAG-3 可以負向調節pDC 的活化，LAG-3 也被認為是pDC 重要的功能標志物。LAG-3 通過基于免疫受體酪氨酸的激活基序（ITAM，immunoreceptor tyrosine-based activation motif）抑制性信號傳導途徑與MHC-Ⅱ的相互結合抑制DC 的增殖和成熟［33］。LAG-3 在pDC 上高度表達，有助于維持pDC 內環境的穩定［34］。

3 PD-1 聯合LAG-3 在腫瘤中的作用

PD-1 作為一種免疫檢查點，可以抑制T 細胞活化。許多研究發現通過特異性抗體阻斷PD-1可以明顯抑制多種腫瘤的進展，如乳腺癌、黑色素瘤、肺癌和結直腸癌等［35-37］。同樣，與PD-1 一樣，LAG-3 也是一種免疫抑制檢查點分子，LAG-3 通過對T 細胞的調節，使抗原特異性CD4+T 細胞增殖減少［38］。已有多項研究使用LAG-3 抗體治療多種惡性腫瘤，其中包括黑色素瘤、胰腺癌和晚期腎細胞癌［39-40］。然而，關于抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體在惡性腫瘤中的研究較少，所以有必要開發針對PD-1 和LAG-3 的新型雙特異性抗體。FGL-1 作為LAG-3 的配體，在體外和體內以受體-配體相互依賴的方式發揮對T 細胞的抑制作用，阻斷FGL-1-LAG-3 的相互作用可以刺激腫瘤微環境中T 細胞的活化和增殖，以提高機體對腫瘤的免疫與清除能力［41-42］。因此，通過阻斷FGL-1-LAG-3 通路和阻斷PD-1，可以為腫瘤的免疫治療提供一種新的治療方法。

4 FGL-1 的結構及功能

FGL-1 是一種肝細胞分泌蛋白，最初是從人肝癌細胞中克隆得到的，并發現其在肝癌患者中高度表達。FGL-1 屬于纖維蛋白原家族，其C 端部分有與纖維蛋白原相關的結構域，該結構域存在于肌腱蛋白、纖維白蛋白、血管生成素、纖維蛋白原b和c 鏈中。FGL-1 與纖維蛋白原β-亞基和γ-亞基的羧基末端氨基酸具有高度同源性，但它不具有纖維蛋白原的3 個功能域：血小板結合位點、交聯區和凝血酶敏感位點。以前的研究發現，FGL-1 的表達在再生肝臟中升高，并且FGL-1 可以刺激原代肝細胞中3H-胸苷的攝取，這說明FGL-1 可以促進肝細胞增殖，因此有人認為FGL-1 是肝臟再生因子。然而另有研究發現，FGL-1 對肝癌細胞生長具有抑制作用，提示其在肝細胞增殖中具有抗增殖作用［43］。

5 FGL-1 作為LAG-3 的主要功能配體在腫瘤中的表達及作用

KIM 等［44］采用BioGPS 組織微陣列數據庫和蛋白質組分析發現，FGL-1 mRNA 和蛋白質主要在人類正常的肝臟和胰腺組織中表達。Oncomine 數據庫的Meta 分析揭示了FGL-1 mRNA 在人類實體腫瘤中高表達的現象，這些腫瘤包括肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和結直腸癌等，與正常組織相比，FGL-1 mRNA 在肺癌中具有最高的上調百分比（35%），而在胰腺、肝臟和頭頸癌中的表達有所降低。此外，惡性腫瘤基因組圖譜數據庫顯示，FGL-1 在肺腺癌中上調程度最高。FGL-1 在前列腺癌和乳腺癌中也顯著上調，但在肝癌中下調。ZHANG 等［45］通過分析50 例胃癌組織及相應癌旁組織中FGL-1的表達，發現胃癌組織中FGL-1 的表達在mRNA 和蛋白水平上均明顯高于癌旁組織，FGL-1 在胃癌組織中上調與預后不良相關。

WANG 等［41］采用基因組規模受體陣列技術，使用IgFc 標記的LAG-3 細胞外結構域融合蛋白（LAG-3-Ig）來檢測LAG-3 的結合蛋白，FGL-1 被證實是LAG-3-Ig 的主要結合蛋白。FGL-1 與LAG-3相互作用具有高度特異性，WANG 等［41］通過流式細胞術進一步驗證了這種相互作用。LAG-3 蛋白由4 個Ig 樣細胞外結構域D1～D4 組成，通過結構域缺失研究發現，LAG-3 中D3～D4 結構域的缺失不影響其與FGL-1 的結合，而單獨的D1 或D2 可以部分降低結合能力，表明D1 和D2 可以影響FGL與1-LAG-3 的相互作用［7-8］。之前有研究發現，LAG-3 D1 結構域的C 鏈中的單點突變（Y73F）可以抑制其與MHC-Ⅱ的結合，然而，該單點突變不影響其與FGL1-Ig 結合，這表明FGL-1-LAG-3 相互作用與MHC-Ⅱ-LAG-3結合并不是無用的。WANG等［41］經過研究發現，FGL1 作為LAG-3 的主要功能性配體，在體外和體內以受體-配體相互依賴的方式對T 細胞起抑制作用，FGL1-LAG-3 相互作用也可能影響記憶T 細胞的產生。基因消除或單克隆抗體可以阻斷FGL1-LAG-3 相互作用以增強T 細胞應答并促進抗腫瘤免疫能力。此外，抗FGL-1單克隆抗體在LAG-3 缺陷型小鼠中沒有抗腫瘤作用，而抗LAG-3 單克隆抗體同樣在FGL-1 缺陷型小鼠中喪失功效。FGL-1 是LAG-3 抑制T 細胞反應的主要配體，WANG 等［41］使用FGL1-KO 小鼠的腫瘤模型研究發現，FGL-1 對依賴于LAG-3 的抗腫瘤免疫具有免疫抑制作用，抗FGL-1 單克隆抗體的抗腫瘤作用依賴于LAG-3，而抗LAG-3 的作用依賴于FGL-1 但不依賴于MHC-Ⅱ或其它LAG-3 配體。鑒于FGL-1 在大多數正常組織中表達有限，而在幾種人類惡性腫瘤中表達上調，并且與這些腫瘤的預后不良和療效不佳相關，因此可以高度選擇性地對高表達FGL-1 的腫瘤患者進行靶向抗體療法。FGL-1 與LAG-3 相互作用是一種獨立的腫瘤免疫逃逸機制，阻斷這種相互作用可能與抗PD 治療產生協同作用。

6 結語

LAG-3 分子作為一種免疫檢查點受體蛋白，在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌及結直腸癌等多種實體腫瘤中異常表達且與疾病預后有關，說明LAG-3 在腫瘤免疫中發揮重要的調控作用。MHC-Ⅱ是LAG-3 的經典配體，LAG-3 可通過與MHC-Ⅱ分子的結合下調T細胞的活性。然而，MHC-Ⅱ是否僅對LAG-3 的抑制功能負責還存在爭議。FGL-1是LAG-3 的一種新發現的配體，在體外和體內以受體-配體相互依賴的方式對T 細胞抑制功能起作用，FGL-1-LAG-3 信號通路可能與惡性腫瘤的免疫逃逸有關，通過阻斷此信號通路的傳導可能有助于惡性腫瘤的免疫治療。然而，FGL-1-LAG-3 信號通路具體的免疫逃逸機制仍然未知。此外，LAG-3不同配體的作用機制以及各配體之間是否存在結構與功能的相關性也不清楚。因此，解決這些關鍵問題有助于優化LAG-3 靶向治療策略，提高惡性腫瘤的治療效果。