一株冢村菌的篩選及其對鄰苯二甲酸二丁酯的降解特性研究

王雨婷，靳 拓，胡 芳，黃仕林，劉慧君*，金德才

（1. 北京農學院，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206；2. 農業農村部農業生態與資源保護總站，北京 100125；3. 湖南省長沙生態環境監測中心，長沙 410001；4. 中國科學院生態環境研究中心，中國科學院環境生物技術重點實驗室，北京 100085）

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters, PAEs）是被廣泛應用于橡膠用品、塑料、涂料、農藥、食品包裝、個人護理用品等領域的一類人工合成的持久性有機化合物［1］。在PAEs被廣泛應用的同時，其對人類健康和生態環境安全的威脅也受到了人們的關注。由于PAEs對整個生態系統具有潛伏性、廣泛性和深遠性的危害，世界各國都十分重視其污染問題。國內外有大量研究表明，PAEs具有致畸性、致癌性、致突變性及生殖毒性［2］，并對人體有低濃度長期危害的特征。目前，鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate, DBP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（benzyl butyl phthalate, BBP）、鄰苯二甲酸二辛酯（dioctyl phthalate, DOP）等多種PAEs已被美國環保局（Environmental Protection Agency, EPA）和中國環境監測總站列為優先控制的污染物。

PAEs在塑料中主要通過氫鍵或范德華力與聚烯烴類分子進行連接，在環境中不易分解。目前在大氣、湖泊、飲用水、土壤甚至室內環境中均可檢測到PAEs的存在［3］，同時，PAEs還可以通過食物鏈進入生物體內［4］，對其造成嚴重危害。

PAEs已經成為我國環境中廣泛存在的一類有機污染物，生物降解是其在環境中降解的主要途徑［5］。DBP主要作為軟化劑應用于聚氯乙烯（polyvinyl chloride, PVC）等合成材料中，是應用最廣泛的PAEs化合物之一。其對環境污染的主要原因是人為造成的，任何來源的DBP均可通過食物鏈進入消化道，最終在人體內蓄積，從而對人體健康構成威脅［6］。國內外對DBP的生物降解進行了大量的研究，主要包括高效降解菌株的篩選和降解動力學研究以及酶促降解性和降解途徑等方面。目前分離得到對DBP具有高效降解性能的菌株主要有紅球菌（Rhodococcussp.）［7-8］、分枝桿菌（Mycobacteriumsp.）［9］、假單胞菌（Pseudomonassp.）［10］、戈登氏菌（Gordoniasp.）［11-12］、芽孢桿菌（Bacillussp.）［13］和皮氏伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pickettii）［14］等，但我國對于PAEs污染物的微生物降解機制、降解基因以及降解酶的研究相對較少，且降解菌菌屬相對集中，需要擴大PAEs的生物降解菌種資源庫。目前，國內外學者對冢村菌（Tsukamurella）的研究相對較少，且關于冢村菌降解PAEs的研究未見報道。

本研究從土壤中篩選出一株能夠把DBP高效降解的菌株SD2，采用16S rDNA序列分析及系統發育樹構建將其鑒定為冢村菌，并分析在不同影響因子條件下菌株SD2的DBP降解特性，為冢村菌降解有機污染物的研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養基

主要試劑：鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate,DMP）；鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate, DEP）；DBP；DOP；甲醇（分析純）和乙酸乙酯（分析純）。

無機鹽培養基 ：K2HPO45.8 g/L，KH2PO44.5 g/L，(NH4)SO42.0 g/L，MgCl20.16 g/L，CaCl20.02 g/L，Na2MoO4·2H2O 2.4 mg/L，FeCl31.8 mg/L，MnCl2·2H2O 1.5 mg/L ；將pH值調至7，121℃高壓滅菌20 min。PAEs固體培養基：在1 L無機鹽培養基中加入20 g瓊脂，121℃高壓滅菌20 min［15］。

1.2 菌株篩選、形態觀察及生理生化鑒定

稱取 1 g 的樣品于 100 mL 含 100 mg/L PAEs（DMP、DEP、DBP、DOP的質量濃度均為25 mg/L）的無機鹽培養基中，采用梯度壓力法馴化，在30℃下振蕩培養7 d。隨后逐步轉接至質量濃度分別為200、300、400、500 mg/L的PAEs無機鹽培養液中培養，每個質量濃度梯度下均馴化7 d左右。用接種環蘸取少量菌液，采用平板劃線法在PAEs固體平板上進行劃線分離純化。選取長勢良好的單菌落接種到PAEs固體平板上，重復此操作，直至得到純的單菌落，并通過肉眼觀察法對分離得到的單菌落的形態進行觀察。生理生化鑒定參考文獻［16］的方法進行。

1.3 細菌底物廣譜性測試

在20 mL的無機鹽培養基中分別加入200 mg/L DBP、200 mg/L DMP、200 mg/L DEP、200 mg/L DOP、200 mg/L鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯［di-(2-ethylhcxyl) phthalate, DEHP］、200 mg/L 甲苯、200 mg/L鄰苯二甲酸單丁酯（mono-n-butyl phthalate, MBP）、200 mg/L 原兒茶酸（protocatechuic acid, PCA）、200 mg/L 鄰苯二甲酸二異辛酯（diisooctyl phthalate,DIOP）、200 mg/L鄰苯二甲酸（phthalic acid, PA）作為菌株生長的唯一碳源，用高壓蒸汽鍋121℃下高壓滅菌20 min。取1 mL菌液至無機鹽培養基中，在溫度為30℃、轉速為150 r/min的搖床中震蕩培養7 d，重復2次，觀察菌株的生長情況。

1.4 細菌的16S rDNA的擴增和系統發育樹的構建

用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴增16S rDNA 片段［17］。50 μL 反應體系含有 10×PCR buffer 5.0 μL、10 mmol/L dNTP 1.0 μL、25 mmol/L MgCl24.0 μL、Taq 酶 0.5 μL、引物 27F 1.0 μL、引物l492R l.0 μL、DNA模板 4.0 μL，其余成分為 ddH2O。反應條件 ：94℃預變性 5 min ；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 90 s，共35個循環 ；72℃延伸10 min，4℃保存。取5.0 μL的反應液進行瓊脂糖凝膠電泳。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）產物的測序工作由睿博興科公司完成，并通過MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹。為了進一步確定該菌的分類地位，本研究將所得到的16S rRNA基因序列通過數據庫EzBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）和細菌模式菌種進行了相似性比對［18］。

1.5 DBP的生物降解試驗

取菌株于含有50 μL DBP的100 mL無機鹽培養液中振蕩培養7 d，離心（轉速為10 000 r/min）5 min，用pH為7、濃度為0.02 mol/L的Na2HPO4·NaH2PO4緩沖液洗滌3次，收集菌體于錐形瓶中。吸取1 mL菌懸液，根據不同條件在含500 mg/L DBP的無機鹽培養基中培養。

1.6 高效液相色譜分析法

1.6.1 樣品處理

將培養后的培養基菌液搖勻，全部轉移至50 mL無菌離心管中，加入10 mL乙酸乙酯，離心（轉速為6 000 r/min）5 min ；收集有機相至燒杯中，用10 mL乙酸乙酯萃取水相1次，并再次收集有機相至燒杯中。在通風櫥中揮發一晚后，用甲醇定容至10 mL，稀釋至原濃度的1/5；用高效液相色譜儀測定DBP的殘留量。

1.6.2 液相色譜條件

色譜柱為SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm×5 μm），柱溫為 35℃，V流動相甲醇∶V水=9∶l，流速為0.5 mL/min。檢測器波長為228 nm，進樣量為20 μL。

1.7 氣相質譜分析

1.7.1 樣品處理

將培養完的菌液轉移至50 mL無菌離心管中，加入10 mL乙酸乙酯，離心（轉速為6 000 r/min）5 min。收集有機相至燒杯中，用10 mL乙酸乙酯萃取水相1次，并再次收集有機相至燒杯中。在通風櫥中揮發干后，用色譜純的正己烷定容至10 mL，稀釋至原濃度的1/5。

1.7.2 氣相質譜條件

Thermo Trace DSQ Ⅱ色譜質譜聯用儀條件 ：1）初始溫度為60℃，以 20℃/min升溫至220℃并保留10 min，隨后以5℃/min升溫至300℃并保留5 min；2）離子源溫度為230℃，全掃描方式進行；3）進樣口溫度為260℃，接口溫度為280℃，流速為1.0 mL/min ；4）進樣量為1 μL。

2 結果與分析

2.1 PAEs降解菌SD2的分離與分子生物學鑒定

通過肉眼觀察法可觀察到菌株SD2在平板上呈白色，菌落較大，表面呈不規則形狀，粗糙，微隆起，不透明，短桿狀，革蘭氏陽性（圖1），專性好氧氣，無鞭毛。

圖1 菌株SD2的革蘭氏染色結果（×100）Fig. 1 Gram staining result of strain SD2 (×100)

本文采用PCR擴增技術獲得了菌株SD2的16S rDNA序列，測序的長度為1 378 bp。用MEGA 7軟件中的Clustal W將其與GenBank中已知菌株的16S rRNA基因序列進行比較，然后用neighbor-joining構建系統發育樹。結果表明，SD2與多種冢村菌的16S rRNA基因相似性高達99%（圖2）。同時，在數據庫EzBioCloud上的比對結果顯示，和SD2最相似的前十二個有效發表模式菌株均為冢村菌，其中SD2和Tsukamurella tyrosinosolvensDSM 44234T相似度為100%，和Tsukamurella ocularisHKU63T相似度為99.85%，和其他屬的相似度均低于96%。因此可以判定SD2屬于冢村菌屬。

圖2 菌株SD2的16S rDNA序列分析與系統發育樹的構建Fig. 2 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree construction of strain SD2

2.2 底物廣譜性試驗

底物廣譜性試驗結果如表1所示。由表1可見，SD2可以利用常見的且在污染環境中含量較高的PAEs類化合物（如DMP、DEP、DBP等），但無法利用支鏈較長的PAEs（如DOP）。同時，SD2對主要的PAEs類化合物中的代謝產物（如PA、PCA）具有一定的利用能力。這預示著SD2具備將PAEs及其代謝產物完全降解的能力。

表1 PAEs降解菌株SD2的底物廣譜性Tab. 1 Substrate utilization profile for strain SD2

2.3 培養條件對菌株降解DBP的影響

2.3.1 初始pH值對菌株降解DBP的影響

用0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L的NaOH調整無機鹽培養基的pH值分別至4、5、6、7、8、9、10，以DBP為唯一碳源，在溫度為30℃、轉速為150 r/min 的條件下振蕩培養3 d。初始pH值對菌株降解DBP的影響如圖3所示。

圖3 初始pH值對菌株SD2降解DBP的影響Fig. 3 Effects of initial pH on DBP degradation by strain SD2

在pH值為4～8時，瓶中殘留DBP的質量濃度呈緩慢下降趨勢，菌株生長緩慢，其對DBP的降解作用受到抑制。在初始pH值為9時，DBP質量濃度為0，表示DBP已經完全被降解，菌株可以良好生長。在初始pH值為10時，菌株生長緩慢，其對DBP的降解作用受到抑制。酸堿度是影響微生物生長的重要因素之一，不同pH值可以影響酶的活性，從而影響菌株降解DBP的能力。由此可見，SD2降解DBP的最適pH值為9。該菌株在偏堿性條件下可以生長，且較適宜降解DBP，同時，初始pH值過低不利于菌株的生長以及DBP的降解。

2.3.2 初始溫度對菌株降解DBP的影響

DBP為唯一碳源，在溫度分別為25、30、35、40和45℃，pH值為7，轉速為150 r/min的條件下振蕩培養3 d，初始溫度對菌株降解DBP的影響如圖4所示。

圖4 初始溫度對菌株SD2降解DBP的影響Fig. 4 Effect of initial temperature on DBP degradation by strain SD2

在25～35℃時，DBP已基本上被SD2完全降解，菌株可以良好生長，具有較高的降解能力。在30℃時，DBP的質量濃度為0，表示DBP已被完全降解。超過35℃時，菌株生長較慢。溫度也是影響微生物生長的重要因素之一，不同的溫度會影響酶的活性，從而影響微生物的生長與降解有機物的能力［19］。由此可見，該菌株適宜在30℃左右溫度下生長，且降解DBP的能力較高。溫度過高會抑制SD2的生長和DBP的降解。

2.3.3 轉速對菌株降解DBP的影響

以DBP為唯一碳源，在溫度為30℃，pH值為7，轉速分別為0、75、150、225 r/min的條件下振蕩培養3 d，轉速對菌株降解DBP的影響如圖5所示。

圖5 轉速對菌株SD2降解DBP的影響Fig. 5 Effect of rotation speed on DBP degradation by strain SD2

在靜止時，SD2對DBP降解的能力較強，菌株可以正常生長。隨著轉速的增加，SD2在不同轉速條件下對降解DBP的影響差別較小，DBP均可以被降解，在不同轉速下菌株都能良好生長。與其他轉速相比，最適宜降解DBP的轉速為150 r/min。

2.3.4 培養時間對菌株降解DBP的影響

以DBP為唯一碳源，在溫度為30℃、pH值為7、轉速為150 r/min的條件下振蕩培養3 d，分別于12、24、36、48、60、72 h時取樣。培養時間對菌株降解DBP的影響如圖6所示。

圖6 培養時間對SD2降解DBP的影響Fig. 6 Effect of culture time on DBP degradation by strain SD2

在培養初期，菌株的生長及DBP的降解速度較快，SD2可以很快利用DBP提供的碳源。在72 h時，DBP可以被完全降解，充分說明SD2是一株高效降解菌。

2.4 代謝產物分析

通過氣相質譜聯用儀（gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS）檢測DBP降解過程中的產物，并與氣質聯用的質譜數據庫進行比對可知，在SD2降解DBP 12 h后，在保留時間（待測組分從進樣到出現峰最大值所需的時間）為9.40 min和8.10 min時檢測到了DBP和鄰苯二甲酸丁基甲酯；SD2降解DBP 36 h后，在保留時間為5.69 min時檢測到了PA。質譜圖如圖7所示。

經菌株SD2降解12 h后，可以檢測到DBP的存在。經菌株SD2降解36 h后，可以檢測到PA，通過降解試驗，在降解36 h后，降解速度趨于平緩，可能是因為反應生成了中間產物鄰苯二甲酸丁基甲酯和PA，而SD2對降解鄰苯二甲酸丁基甲酯和PA的能力較弱，從而導致降解速度變慢。降解72 h后幾乎沒有檢測到DBP及其中間產物，表明DBP已幾乎被完全降解。

圖7 鄰苯二甲酸二丁酯及其代謝產物的質譜圖Fig. 7 Mass spectrum of dibutyl phthalate and its metabolic product（a）鄰苯二甲酸二丁酯的質譜圖；（b）鄰苯二甲酸丁基甲酯的質譜圖；（c）PA的質譜圖。(a) Mass spectrum of dibutyl phthalate； (b) Mass spectrum of butylmethyl phthalate； (c) Mass spectrum of phthalic acid.

研究表明，在好氧微生物的降解過程中，通過微生物酯酶將PAEs水解可生成鄰苯二甲酸單酯，并將其再生為PA。而成功降解PA才是完成整個降解過程的一個至關重要的步驟［20］。結合底物廣譜試驗結果可知，該菌能繼續利用PA以及后續的代謝產物PCA，基本可以推測該菌能夠完全降解DBP。

3 討論

冢村菌是一類需氧、不產芽孢、無動力的革蘭氏陽性菌，主要分布于土壤、水以及活化淤泥的泡沫中［21］。雖然對于微生物可降解PAEs的研究很多，但是目前有關于冢村菌的生物降解研究的報告不多，僅有冢村菌降解十六烷和烷烴的研究報道［22-23］。本文第一次報道了該菌屬能夠降解PAEs污染物的研究。

本研究對冢村菌的降解特性及降解產物進行了分析。從農田土壤中篩選出一株能夠以DBP為唯一碳源和能源生長的微生物SD2。經PCR擴增得到其16S rDNA并構建分子系統發育樹，分析發現SD2與多種冢村菌的16S rRNA基因的相似性高達99%。因此，初步鑒定該菌株為冢村菌。通過底物廣譜性試驗發現，菌株SD2可以利用多種常見的PAEs類化合物，是一株能夠廣泛降解PAEs的菌株。本研究利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）測定了SD2的降解性能，發現了SD2對DBP的最佳降解條件：溫度為30℃，pH值為9，轉速為150 r/min。在該最佳條件下，SD2在72 h內可以完全降解500 mg/L的DBP，表明該菌偏愛在偏堿性環境中生長，并具備較高的DBP降解能力。通過GC-MS分析可初步推斷，SD2與DBP反應生成的中間產物為鄰苯二甲酸丁基甲酯和PA。結合底物廣譜試驗可知，PA及PCA均能被SD2降解，預示SD2可以完全降解DBP，并將土壤中PAEs轉化為CO2和H2O，同時不會產生二次污染。下一步將開展該菌種的降解機制研究，通過基因組和轉錄組測序，預測相關的降解基因并測定相關的酶活性質，為后續的應用開發提供基礎。

總之，本研究所篩選的冢村菌的底物廣譜性良好，降解速度快，在降解PAEs及其中間代謝產物中起到了重要作用，對環境污染的治理及修復具有一定的應用潛力，同時進一步擴大了PAEs生物降解菌資源，并為冢村菌降解有機污染物的研究提供了有利參考。