基于裝載白藜蘆醇的脂質體包裹介孔碳納米管用于靶向及近紅外激光觸發的化療/光熱協同腫瘤治療

李 璟，伍 旭，彭 倩，王晨旭，楊 凡*

（1. 湖南省人民醫院老年醫學研究所，長沙 410016；2. 中南大學腫瘤研究所，長沙 410078）

介孔材料是一類孔徑介于2～50 nm之間的多孔材料，具有有序而穩定的納米級孔隙和巨大的比表面積，因此其作為藥物載體系統有著巨大的應用前景［1］。介孔碳納米管（mesoporous carbon nanotube,MCN）是介孔材料中的一員，其不僅具有介孔材料本身固有的優點，而且還具有出色的光熱轉化能力，可以用于腫瘤的光熱治療（photothermal therapy,PTT）［2］。近年來，基于MCN的腫瘤光熱治療體系受到研究人員的廣泛關注，成為頗為熱門的研究對象［3］。Chen等［4］制備了具有磁性和熱敏感性的有序介孔碳納米球，并裝載了抗腫瘤藥物阿霉素（doxorubicin, DOX），用于腫瘤的化療/光熱協同治療。Cai等［5］開發了基于氧化介孔碳納米顆粒的藥物轉運體系，在顆粒表面修飾長鏈聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）分子，介孔內裝載藥物DOX，并用氨基化的氧化鋅量子點封堵介孔口，用于腫瘤的化療/光熱協同治療。

白藜蘆醇（resveratrol, Res）是最初從植物中提取得到的一種活性多酚類物質，是植物為了抵御細菌或真菌入侵而產生的抗毒素［6］，其在抗腫瘤和治療心血管疾病、肥胖、糖尿病等方面有一定的療效［7］，是一種極具前景的抗癌分子。然而，Res在臨床中的應用效果卻不盡如人意，主要是由于：1）Res為脂溶性物質，在水中的溶解度小于68.8 μg/mL，所以通過口服的吸收率極低［8］；2）Res在體內代謝迅速，其在人體血液中的半衰期約為8～14 min，難以保持較高的血藥濃度［9］；3）Res有順式（cis-）和反式（trans-）兩種異構體，其活性形式為trans-Res，然而，trans-Res的穩定性非常差，暴露在紫外光下會迅速異構化為無活性的cis-Res［10］。因此，Res的生物利用度非常低，因到達體內作用位點的藥物濃度達不到有效濃度，導致其在體內的實際效果有限。

本文擬發展一種基于MCN的Res載藥系統，希望能夠高效地增加Res的水溶性、穩定性及生物利用度。同時，利用MCN的光熱轉化能力，實現近紅外（near infrared, NIR）激光刺激-響應的藥物定點釋放，進一步通過修飾葉酸靶向分子實現藥物的靶向定點釋放。更為重要的是，將腫瘤的化療與光熱治療有機地結合起來，可發揮兩者各自的優勢，以達到最大的療效，產生最小的毒副作用，避免多藥耐藥的產生。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MCN購自南京先豐納米材料科技有限公司；Res、atto647N-生物素（atto647N-biotin, ATTO）、鏈霉親和素（streptavidin, SA）購自美國Sigma-Aldrich公司；1,2-二肉豆蔻?；字８视停?,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, DMPG）購自美國Avanti公司 ；葉酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺［1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly（ethylene glycol）5000-folate, FA-PEG-DSPE］、生物素-聚乙二醇-二硬脂?；字Ｒ掖及罚?,2-distearoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly（ethylene glycol）2000-biotin, biotin-PEG-DSPE］購自美國 Nanocs公司 ；噻唑藍（methylthiazole tetrazolium, MTT）購自上海梯希愛化成工業發展有限公司；胎牛血清、羅斯威爾帕克紀念研究所 -1640（roswell park memorial institute-1640,RPMI-1640）培養基和細胞消化液購自美國Gibco公司 ；Hoechst 33342購自美國Invitrogen公司 ；所有試驗用水均為超純水（電阻率＞18.2 MΩ·cm）；人乳腺癌細胞 MCF-7（Michigan cancer foundation-7）、人肺癌細胞A549由本實驗室細胞中心提供；雌性BALB/c裸鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

F-20型高分辨透射電鏡（transmission electron mi-croscope, TEM）（日本電子光學研究所）；F-7000型熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；DU-800型紫外-可見分光光度計（美國Beckman公司）；3000HS型Zetasizer分析儀（美國Malvern公司）；E60型紅外熱成像儀（美國FLIR公司）；LSM900型激光共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss）；SB2200-T型超聲波清洗器（美國Branson公司）；Synergy LX型酶標儀（美國BioTek公司）；Direct Q8型超純水裝置（法國Merck Millipore公司）；HERAcell 150i型細胞培養箱（德國Thermo公司）。

1.2 試驗原理

如圖1所示，首先采用薄膜水化法制備納米脂質體。納米脂質體的組成成分為：1）DMPG，其能使脂質體成型并帶負電荷；2）具有葉酸受體靶向能力的磷脂FA-PEG-DSPE；3）可修飾熒光染料的磷脂biotin-PEG-DSPE，在脂質體合成后通過鏈霉素-親和素的方法將NIR熒光染料ATTO修飾在納米脂質體上，用于熒光示蹤。隨后，利用MCN內介孔結構吸附抗腫瘤藥物Res。同時，在MCN表面包裹葉酸-聚乙二醇-脂質體（folate-polyethylene glycol-liposome, FA-PEGLip），用于對MCN的介孔進行封堵，防止Res提前釋放。FA-PEG-Lip的包裹原理為：在超聲條件下，脂質體中的磷脂分子通過親疏水作用發生重排，磷脂疏水性的尾部傾向于同樣疏水的MCN納米管表面，親水性的磷脂頭部朝向外側。最終形成裝載Res的FAPEG-Lip包裹的MCN（FA-PEG-Lip@MCN/Res）納米體系。

圖1 FA-PEG-Lip@MCN/Res多功能納米體系的制備及其應用于葉酸受體介導的靶向化療/光熱協同腫瘤治療原理圖Fig. 1 Schematic illustration of the synthesis of FA-PEG-Lip@MCN/Res nanocomposites and their application for folate-mediated targeted chemo/photothermal synergistic cancer therapy

FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系通過尾靜脈注射進入小鼠體內，經血液循環進入腫瘤部位后，可以通過葉酸受體的靶向識別停留在腫瘤細胞表面，并通過細胞內吞過程進入腫瘤細胞內。在NIR激光的照射下，FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系將所吸收的光能轉化為熱能。光致升溫不僅可以使納米體系從內涵體中逃逸到細胞質中，而且可以使FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系外層包裹的FA-PEG-Lip磷脂脫落，使MCN的介孔失去封堵物，從而將Res從MCN的介孔內釋放出來。釋放在細胞質中的Res可以作用于線粒體，進而作用于細胞核，誘導腫瘤細胞凋亡。光致高溫本身也能夠誘導細胞內的關鍵蛋白變性，誘導腫瘤細胞凋亡。因此，通過化療/光熱協同治療可實現高效的腫瘤殺傷。

1.3 FA-PEG-Lip@MCN納米復合體系的制備

1.3.1 FA-PEG-Lip和FA/biotin-PEG-Lip納米脂質體的制備

首先采用薄膜水化法制備FA-PEG-Lip納米脂質體［11］。將DMPG、FA-PEG-DSPE按照物質的量之比為9∶1（總的物質的量為3 μmol）溶于3 mL氯仿/甲醇溶液中。然后，將上述溶液置于圓底燒瓶中，在旋轉蒸發儀上37℃水浴條件下減壓蒸干有機溶劑，得到一層附在圓底燒瓶內壁的薄脂膜。將含脂膜的圓底燒瓶置于玻璃真空干燥機內干燥過夜，以完全去除殘留的有機溶劑。隨后，將4 mL超純水加入脂膜中，60℃水浴超聲10 min，使脂膜在水溶液中自組裝成磷脂雙分子層的納米脂質體。最后，使用注射劑將上述脂質體溶液過0.22 μm的聚碳酸酯膜2次，得到粒徑分布相對均一的脂質體溶液。將該脂質體溶液保存在4℃環境中備用。

含有生物素基團修飾的葉酸/生物素-聚乙二醇-脂質體（FA/biotin-PEG-Lip）的制備所加入的組成磷脂為DMPG、FA-PEG-DSPE和biotin-PEG-DSPE，且3種磷脂物質的量之比為17∶2∶1，總的磷脂含量保持在3 μmol。其他過程與上述FA-PEG-Lip脂質體制備過程基本相同。

1.3.2 FA/ATTO-PEG-Lip納米脂質體的制備

為了獲得NIR熒光成像的能力，本文將NIR熒光染料ATTO通過親和素-生物素交聯的方法修飾到上述合成的FA/biotin-PEG-Lip脂質體表面。將0.004 mmol/L SA加入4 mL FA/biotin-PEG-Lip脂質體中，在37℃金屬浴中震蕩反應1 h，得到FA/SA-biotin-PEG-Lip脂質體。最后，將0.040 mmol/L的ATTO加入體系中繼續反應1 h，得到FA/ATTO-SA-biotin-PEGLip。使用截留量為10 kD的透析袋透析過夜，以去除過量的游離染料。簡便起見，下文將FA/ATTO-SA-biotin-PEG-Lip縮寫為FA/ATTO-PEG-Lip。

1.3.3 FA-PEG-Lip@MCN和FA/ATTO-PEG-Lip@MCN納米復合體系的制備

將 5 mg MCN 粉末加入 20 mL FA-PEG-Lip 溶液中，然后將混合液置于冰水浴中，使用超聲波細胞破碎儀（功率：200 W）超聲3 h。得到的產物以3 000 r/min的轉速離心15 min，以去除未被脂質體包裹的MCN。小心收集上清溶液，即為FA-PEG-Lip包裹的MCN（FA-PEG-Lip@MCN）。通過將FA-PEG-Lip溶液替換成FA/ATTO-PEG-Lip溶液，并使用相同的超聲包裹的方法可以得到FA/ATTO-PEG-Lip包裹的MCN（FA/ATTO-PEG-Lip@MCN）。

1.4 抗腫瘤藥物Res的裝載與NIR激光控制的藥物釋放行為的研究

本試驗以抗腫瘤藥物Res為模式藥物，通過FAPEG-Lip@MCN對Res的裝載來評估所構建的藥物轉運體系的藥物裝載能力及NIR激光控制的藥物釋放行為。將不同質量濃度的Res溶液、1 mg/mL MCN溶液與FA-PEG-Lip溶液混合，并在冰水浴中超聲處理8 h，制備裝載Res的FA-PEG-Lip@MCN（FA-PEGLip@MCN/Res）。未裝載的游離Res分子通過截留分子量為100 kD的超濾管離心去除。

建立Res的標準曲線，以測量Res在FA-PEGLip@MCN/Res納米體系中的載藥量。然后，采用紫外 -可見分光光度計測定1 mg/mL FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液在306 nm處的吸光度（A），同時測定未裝載Res的納米體系FA-PEG-Lip@MCN在306 nm處的吸光度（A0），通過A減去A0即可得到納米體系內裝載的Res分子在306 nm的吸光度。根據所建立的標準曲線計算得到Res的裝載質量。并通過公式（1）計算得到Res的載藥量：

NIR激光刺激的Res釋放行為的考察在37℃、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）中進行。以780 nm半導體激光器作為NIR光源，同時設置沒有NIR激光照射的FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系作為對照。取少量FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系置于2 mL離心管中，加入1.5 mL PBS緩沖液溶液。每隔一定時間，采用功率密度為0.8 W/cm2的NIR激光照射樣品10 min，取200 μL激光照射后的樣品高速離心（10 000 r/min，15 min），通過測量上清液中Res分子在306 nm處的紫外-可見吸收值來考察Res從納米體系中釋放的情況。進一步通過已建立的Res標準曲線計算所釋放Res的質量，最后根據公式（2）求得在NIR激光刺激下的Res釋放曲線。將測量完畢的上清液放回上述樣品體系中以保持體系的總體積不變。

1.5 FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res對腫瘤細胞的靶向識別效果的考察

以具有熒光示蹤能力的FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系為對象，考察其對葉酸受體陽性的MCF-7細胞的特異性識別效果，采用葉酸受體陰性的A549細胞作為對照。先分別將A549細胞和MCF-7細胞以1×104個/孔的密度均勻地鋪在35 mm的激光共聚焦皿中，培養過夜，使細胞充分貼壁。然后，用D-Hanks緩沖液清洗細胞，加入200 μL無血清培養基，將100 μg/mL FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系分別加入MCF-7及A549細胞中，在冰上孵育20 min，以提供納米體系靶向識別機會，避免非特異性吸附。用D-Hanks緩沖液清洗兩組細胞后，用Hoechst 33342染核10 min。最后將細胞孵育在PBS緩沖液中，使用激光共聚焦顯微鏡（100倍油鏡）拍照。

1.6 細胞水平上NIR激光刺激的化療/光熱協同治療效果的考察

通過細胞毒性試驗考察納米體系對MCF-7細胞的化療/光熱協同殺傷效果。首先，將處于對數生長期的MCF-7細胞（1×105個/孔，100 μL）接種于96孔板內，在37℃、5%CO2的環境下培養過夜。然后向細胞中分別加入20 μL不同質量濃度的Res、FAPEG-Lip@MCN和FA-PEG-Lip@MCN/Res。37℃條件下孵育3 h后，用D-Hanks緩沖液清洗，并向每孔加入100 μL含10%FBS的新鮮培養基。按照試驗的分組情況，對需要NIR激光照射組采用功率密度為0.8 W/cm2的780 nm激光器照射5 min后，在37℃、5%CO2的環境下繼續培養 24 h。隨后，加入 20 μL MTT試劑，孵育4 h。小心去除含MTT的培養基，將150 μL DMSO加入每個孔中。震蕩3 min后，用酶標儀測定樣品在490 nm處的吸光值。以上試驗均重復3次。以沒有經過任何處理的細胞作為對照組，以未加入任何細胞或者試劑孔的紫外-可見吸收值為空白組，按照公式（3）計算細胞存活率：

1.7 活體水平上NIR激光刺激的化療/光熱協同治療效果的考察

首先制備MCF-7荷瘤裸鼠模型，通過皮下注射將200 μL分散在PBS緩沖液中的MCF-7細胞注射在BALB/c裸鼠的后腿上部。等待數日，當腫瘤體積生長到大于100 mm3時，隨機將荷瘤裸鼠分為5個試驗組（n=3）：陰性對照組（PBS + NIR光照）、游離藥物組（Res處理）、單獨化療組（FA-PEG-Lip@MCN/Res處理）、單獨PTT組（FA-PEG-Lip@MCN + NIR光照）、化療/PTT組（FA-PEG-Lip@MCN/Res + NIR光照）。各種不同納米體系通過尾靜脈分別注射進入各試驗組荷瘤小鼠體內。以MCN的質量計算，納米體系注射劑量為2 mg/kg。需要NIR激光照射時，780 nm激光以0.8 W/cm2功率密度在腫瘤組織上連續照射5 min。每隔1 d采用游標卡尺監測腫瘤大小的變化，并根據公式（4）計算腫瘤的體積。采用相對腫瘤體積（V/V0）描述腫瘤大小的變化，其中V0為第0天測量得到的腫瘤體積，V為第n天測量得到的腫瘤體積。同時，每隔1 d稱量小鼠體重，以監測可能產生的藥物急性毒性。

2 結果與分析

2.1 FA-PEG-Lip@MCN納米復合體的制備及表征

基于納米脂質體中的磷脂與MCN之間的親疏水作用制備得到葉酸-聚乙二醇-脂質體包裹的MCN（FA-PEG-Lip@MCN）納米體系。采用TEM表征裸的MCN及經過脂質體包裹后FA-PEG-Lip@MCN的形貌及粒徑。結果顯示，MCN具有典型的介孔結構（圖2a），寬為（90±10）nm，長為（900±100）nm。而FA-PEG-Lip@MCN（圖2b）在經過納米脂質體的包裹后，仍然保留了規律的介孔結構，寬度也沒有發生太大變化［（80±10）nm］，但是長度有所降低［（600±100）nm］。FA-PEG-Lip@MCN長度的減少是由于脂質體包裹過程中的超聲處理所致。X射線能譜（energy-dispersive X-ray spectrum, EDS）顯示（圖 2c），MCN主要由碳元素組成（另外的銅元素峰來自銅網），說明該碳納米管是由高純度的碳元素構成的。FA-PEGLip@MCN納米體系除碳元素外還出現了磷元素的特征峰（圖2d），而磷元素來自MCN表面包裹的脂質體。該數據初步證實FA-PEG-Lip可以成功地包裹在MCN納米片表面?；瘜W元素面掃分析顯示（圖2e），FAPEG-Lip@MCN納米體系出現了4種元素共定位，其中碳元素來自MCN，氮元素、氧元素和磷元素來自表面包裹的FA-PEG-Lip，這再次證實了FA-PEG-Lip可以成功地包裹在MCN納米片表面。繼續采用動態光散射（dynamic light scattering, DLS）法考察制備得到的FA-PEG-Lip@MCN納米體系。如圖3a所示：裸MCN納米管的表面電位為+22.7 mV；由帶負電荷的納米脂質體（Zeta電位：-38.3 mV）包裹形成FA-PEG-Lip@MCN后表面電位下降為-10.2 mV。表面電位測定結果再次為脂質體成功地包裹在MCN上提供了堅實的證據。綜上所述，通過一系列試驗，從元素組成變化、Zeta電位變化等方面均能證明FA-PEG-Lip@MCN納米體系制備成功。

圖2 不同樣品的透射電鏡、能譜圖和元素面掃描圖Fig. 2 TEM images, EDS data and elemental mapping results of different samples（a）MCN納米管的透射電鏡圖；（b）FA-PEG-Lip@MCN納米體系的透射電鏡圖；（c）MCN納米管的X-射線能譜圖；（d）FA-PEG-Lip@MCN納米體系的X-射線能譜圖（插入圖為放大倍數更大的透射電鏡圖）；（e）FA-PEG-Lip@MCN納米體系的元素面掃描圖。HAADF：高角度環形暗場成像圖；C：碳元素維度分布（紅色）；N：氮元素維度分布（橙色）；O：氧元素維度分布（黃色）；P：磷元素維度分布（綠色）。(a) TEM image of MCN nanotubes； (b) TEM image of FA-PEG-Lip@MCN nanocomposites； (c) EDS data of MCN nanotubes； (d) EDS data of FAPEG-Lip@MCN nanocomposites (the insert shows the TEM images with higher magni fication)； (e) Elemental mapping results of FA-PEG-Lip@MCN.HAADF: High-angle annular dark field image； C: Elemental mapping image of C (red)； N: Elemental mapping image of N (orange)； O: Elemental mapping image of O (yellow)； P: EDS elemental mapping image of P (green).

用小角度X射線衍射（X-ray diffraction, XRD）對合成的MCN進行了表征。結果如圖3b所示，MCN及FA-PEG-Lip@MCN在2θ≈1°附近均出現了典型的無定型介孔結構的衍射峰，進一步證明了納米脂質體的包裹對FA-PEG-Lip@MCN納米體系的介孔結構基本沒有影響，為其作為抗腫瘤藥物載體提供了基礎。此外，廣角XRD（圖3c）的2θ值在24°～43°之間有一個寬的衍射峰，表明合成的MCN納米管具有無定形介孔碳的性質。氮氣吸附-解吸表明（圖3d），合成的MCN在相對壓力（P/Po）≈ 0.4處具有典型的IV型曲線，通過Barrett-Joyner-Halenda模型計算得到介孔尺寸為3.4 nm。MCN具有規則的介孔結構，能夠為藥物的吸附提供巨大的比表面積，因而可作為藥物載體。

2.2 合成FA-PEG-Lip@MCN/Res的表征

圖3 不同樣品的表征結果Fig. 3 Characterization of different samples（a）Zeta電位結果；（b）小角度X衍射圖；（c）廣角X衍射圖；（d）氮氣吸附-脫附圖譜（插入圖為相應的孔徑分布圖）。(a) Zeta potential results； (b) Small-angle XRD pattern； (c) Wide-angle XRD pattern； (d) N2 adsorption-desorption isotherms (the insert shows the corresponding pore diameter distributions).

在證明FA-PEG-Lip@MCN的成功合成后，本文選擇了Res作為模式藥物研究該納米體系的載藥性能。Res是一種活性多酚類物質，其在抗腫瘤、治療心血管疾病、肥胖、糖尿病等方面有一定的防治作用［7］。但是由于其為脂溶性藥物，在體內代謝迅速，因此，游離Res到達體內作用位點的藥物濃度達不到所需的量，在生物體內的實際效果有限。本文通過將Res與MCN、FA-PEG-Lip混合并超聲處理制備裝載Res的FA-PEG-Lip@MCN（FA-PEG-Lip@MCN/Res）納米體系，擬提高其水溶性和穩定性，以達到安全、高效地增強Res療效的目的。測定FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的紫外-可見吸收光譜的結果如圖4a所示。在306 nm處發現了Res的特征吸收峰，初步證明Res分子可以被成功裝載到FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系中。根據文獻報道，MCN對吸附在其表面的熒光分子有強烈的淬滅作用［12］，所以本文通過測量同質量濃度的Res在裝載進入FA-PEGLip@MCN/Res納米體系前后的熒光發射光譜來驗證其是否成功裝載。使用325 nm光激發FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系，在400 nm處觀察Res熒光發射光譜的強度變化。如圖4b所示，Res在裝載進入FAPEG-Lip@MCN/Res納米體系后，熒光強度明顯下降，僅存在一個微弱的熒光發射峰。這是由于Res分子吸附在MCN表面后其熒光被MCN淬滅所致。通過紫外-可見分光光度計測量FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的吸收值，并根據Res的標準曲線計算出Res在FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的載藥量約為 131.59 mg/g MCN。

圖4 不同樣品的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的表征結果Fig. 4 UV-vis absorption spectra and fluorescence spectra of different samples（a）FA-PEG-Lip@MCN/Res的紫外-可見吸收光譜 ；（b）FA-PEG-Lip@MCN/Res的熒光光譜 ；（c）FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res的紫外-可見吸收光譜；（d）FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res的熒光光譜（插入圖為熒光成像照片）。(a) UV-vis absorption spectra of FA-PEG-Lip@MCN/Res； (b) Fluorescence spectra of FA-PEG-Lip@MCN/Res； (c) UV-vis absorption spectra of FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res； (d) Fluorescence spectra of FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res (the insert shows the fl uorescence images).

將NIR熒光染料ATTO通過鏈霉素-親和素交聯的方法修飾到納米體系上制備ATTO交聯的FA-PEGLip@MCN/Res（FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res），以獲得NIR熒光示蹤能力。如圖4c所示，采用紫外-可見分光光度計測定FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res的吸收光譜，發現在647 nm處出現了ATTO的特征吸收峰。隨后測定FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的熒光光譜發現（圖4d），FA-PEG-Lip@MCN/Res沒有任何熒光，而在修飾帶ATTO染料的脂質體后，FA/ATTOPEG-Lip@MCN/Res納米體系發出了較強的熒光信號，證明FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res確實具有較好的熒光示蹤能力。

為考察FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的光熱升溫能力，本文采用780 nm激光以0.8 W/cm2的功率密度照射不同質量濃度的FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液，實時監測溶液的溫度變化。結果如圖5a所示，超純水對照的溫度僅輕微上升到30.5℃。而不同質量濃度的FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液則有明顯的升溫，質量濃度為31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 μg/mL 的 FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液經過5 min的NIR激光照射后，溫度分別上升到44.5、48.1、53.2、56.4和61.2℃。紅外熱成像儀拍攝的熱成像圖則更為直觀地展示了溫度的變化情況。如圖5b所示，FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系的溫度表現出與質量濃度及NIR激光照射時間呈正相關。此外，經過5輪的反復升溫，該納米體系的升溫能力未發生明顯衰減（圖5c），說明該FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系具有良好的光熱穩定性。有文獻報道，大于45℃的溫度就能夠引起腫瘤細胞的凋亡［13］。所以，FA-PEGLip@MCN/Res納米體系能夠作為光熱試劑應用于腫瘤的PTT。

圖5 光熱升溫效率的考察Fig. 5 Investigation of photothermal transduction efficiency（a）不同質量濃度的FA-PEG-Lip@MCN/Res用NIR激光（780 nm，0.8 W/cm2）照射后的溫度變化 ；（b）不同質量濃度的FA-PEG-Lip@MCN/Res在NIR激光照射下的紅外熱成像圖；（c）FA-PEG-Lip@MCN/Res經過5輪循環的光熱穩定性考察。(a) Photothermal heating curves of FA-PEG-Lip@MCN/Res with different concentrations upon NIR laser exposure (780 nm, 0.8 W/cm2)；(b) Thermal imaging photographs of different concentrations of FAPEG-Lip@MCN/Res upon NIR laser illumination； (c) The photothermal stability of FA-PEG-Lip@MCN/Res for five cycles.

2.3 NIR激光觸發的藥物控制釋放行為的考察

能使所包裹的藥物分子以NIR激光刺激-響應的方式釋放是本文的主要設計意圖之一。故本文對比了FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系在有、無NIR光刺激的情況下藥物的釋放行為。如圖6所示，在沒有NIR激光照射的情況下，FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系中Res的釋放較少，在整個240 min的考察期間，僅有不到40%的藥物釋放。而加入NIR激光照射刺激后，FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系表現出瀑布型的藥物突釋。例如：在第50分鐘使用780 nm激光以0.8 W/cm2的功率密度進行10 min照射后，藥物的釋放量由15.47%增加到34.41%。當停止NIR光照之后，藥物的釋放速率則隨之降低。重新進行光照后，藥物釋放再次加速，以此往復。具體的情況為：在第110分鐘進行NIR激光照射后，Res的釋放量由43.95%增加到60.66%；在第170分鐘進行NIR激光照射后，藥物的釋放量由68.73%增加到80.75%；經過第230 分鐘NIR激光照射后，藥物的釋放量由85.71%增加到90.88%。綜上所述，FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系中的Res可以在NIR激光照射刺激下實現可控釋放。

圖6 FA-PEG-Lip@MCN/Res溶液在有、無NIR激光（780 nm，0.8 W/cm2）照射下Res的釋放曲線Fig. 6 NIR-laser-triggered release behavior of FA-PEG-Lip@MCN/Res with or without NIR laser (780 nm, 0.8 W/cm2) illumination

2.4 FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res對腫瘤細胞的靶向識別效果考察

為驗證所構建的FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系對腫瘤細胞的靶向識別效果，本文采用修飾了NIR熒光染料ATTO的FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res考察其對葉酸受體陽性腫瘤細胞的特異性識別情況。如圖7所示，激光共聚焦（confocal laser scanning microscopy, CLSM）試驗表明，葉酸受體陽性的MCF-7細胞表面出現較強的紅色熒光信號，而葉酸受體陰性的A549細胞表面則僅有微弱的熒光信號，這是由于FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系經由葉酸受體介導的識別作用特異性結合到了MCF-7細胞上所致。以上結果可以證實，FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res納米體系確實能夠靶向識別葉酸受體陽性的MCF-7細胞。

圖7 特異性識別效果的考察Fig. 7 Specific binding assay將FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res分別與葉酸受體陰性的A549細胞和葉酸受體陽性的MCF-7細胞孵育后的激光共聚焦顯微鏡成像圖。其中藍色代表Hoechst 33342的熒光，紅色代表ATTO染料的熒光。CLSM images of folate receptor-negative A549, and folate receptorpositive MCF7 cells treated with FA/ATTO-PEG-Lip@MCN/Res.Blue represents the fl uorescence of Hoechst 33342, red represents the fl uorescence of ATTO dye.

2.5 腫瘤細胞化療/光熱協同殺傷效果的考察

良好的生物相容性是一個具有臨床應用前景的納米藥物運輸載體的必備條件之一。在考察納米體系腫瘤治療效果之前需先評價藥物載體FAPEG-Lip@MCN本身的生物安全性。如圖8a所示，與FA-PEG-Lip@MCN孵育后的MCF-7細胞表現出良好的存活率，即使FA-PEG-Lip@MCN的質量濃度高達80 μg/mL時，MCF-7細胞的存活率仍然保持在92.43%。以上結果說明藥物載體FA-PEG-Lip@MCN擁有良好的生物相容性。

圖8 細胞水平上的協同治療Fig. 8 Synergistic therapy in vitro（a）不同質量濃度的FA-PEG-Lip@MCN對MCF-7細胞的毒性考察；（b）不同治療方式對MCF-7的殺傷效果。(a) Cytotoxicity assays of different concentration of FA-PEG-Lip@MCN with MCF-7 cells； (b) Cytotoxicity assays of MCF-7 cells following various treatments as indicated.

同時，本文進一步開展了細胞水平上的化療/光熱協同腫瘤治療的研究。如圖8b所示，游離Res（黑色柱）對MCF-7細胞的殺傷能力較弱，即便將游離Res的質量濃度提高到10.5 μg/mL，其對腫瘤細胞的治療效果仍然非常有限。當將Res裝載到FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系內時，FA-PEG-Lip@MCN/Res（綠色柱）對MCF-7細胞的殺傷效果有一定提升（Res：85.03% vs FA-PEG-Lip@MCN/Res：75.02%）。同時，單獨PTT組（紅色柱）也展現出了一定的腫瘤細胞殺傷能力，用質量濃度為80 μg/mL（以復合體系中MCN的質量濃度計算）的FA-PEG-Lip@MCN + NIR處理后的MCF-7細胞存活率為59.11%。而化療/光熱協同治療組（紫色柱）取得了最好的腫瘤細胞治療效果，用質量濃度為80 μg/mL（以復合體系中MCN的質量濃度計算）的FAPEG-Lip@MCN/Res + NIR處理后的MCF-7細胞存活率僅僅為31.23%。以上結果初步證明FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系具有化療/光熱協同腫瘤治療的能力。

2.6 活體水平上的化療/光熱協同腫瘤治療效果的考察

圖9 活體水平上的協同治療Fig. 9 Synergistic therapy in vivo（a）具有代表性的荷瘤小鼠經過不同處理的照片；（b）不同治療組荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線；（c）不同治療組的荷瘤小鼠的體重變化曲線。(a) Digital photographs of representative mice with different treatments； (b) Tumor growth curves of different groups of tumor-bearing mice after various treatment； (c) Body weight curves of different groups of tumor-bearing mice after various treatment.

在獲得FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系對腫瘤細胞有高效的化療/光熱協同殺傷結果后，本文進一步在更為復雜的活體水平上開展了腫瘤協同治療試驗。將荷瘤裸鼠隨機分為以下5個試驗組：1）陰性對照組（PBS + NIR光照）；2）游離藥物組（Res處理）；3）單獨化療組（FA-PEG-Lip@MCN/Res處理）；4）單獨PTT組（FA-PEG-Lip@MCN + NIR光照）；5）化療/PTT協同治療組（FA-PEG-Lip@MCN/Res + NIR光照）。在進行完各組治療后，每隔1 d使用游標卡尺測量腫瘤的大小，根據公式算出腫瘤的相對體積，并繪制腫瘤的生長曲線，以此判斷各組的治療效果。如圖9a和9b所示：試驗組1（PBS + NIR光照）中荷瘤裸鼠的腫瘤生長基本沒有受到任何抑制，其腫瘤仍然以較快的速度在長大；試驗組2（游離Res處理）對腫瘤生長抑制的能力仍然非常有限，可能由于游離Res在活體內被快速代謝所致；試驗組3（FA-PEG-Lip@MCN/Res單獨化療）中腫瘤的治療效果明顯好于同質量濃度游離Res的療效，這可能是由于Res在裝載進入FAPEG-Lip@MCN/Res后，其穩定性及生物利用度有所提升［14］；試驗組4（FA-PEG-Lip@MCN + NIR光照）中腫瘤的生長速度同樣有所減緩，說明單獨PTT也有一定的療效；令人印象深刻的是，試驗組5（FA-PEGLip@MCN/Res + NIR光照）中腫瘤生長被完全抑制。試驗組5之所以取得良好的治療效果，是因為該納米體系所具有的葉酸受體靶向運輸能力、抗腫瘤藥物的控制釋放以及化療與PTT的協同殺傷多種功能共同作用的結果。同時本文監測了各組小鼠在治療過程中體重的變化情況（圖9c），結果沒有發現小鼠體重減輕的情況，說明各個組治療后均沒有產生急性毒副作用。以上結果說明，FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系在活體水平上取得了良好的化療/光熱協同腫瘤治療效果。

3 討論

惡性腫瘤已經成為中國人的主要死亡原因之一［15］，中國醫學科學院腫瘤醫院赫捷院士團隊［16］的最新癌癥統計數據顯示，在我國，全年惡性腫瘤發病約392.9萬人，死亡約233.8萬人。這意味著，我國每1分鐘即有7.4人被確診患癌，4.4人死于惡性腫瘤，其防控形勢異常嚴峻。而化療、放療、手術治療等傳統的腫瘤治療方法存在靶向能力差、毒副作用大及復發率高等缺陷［17］。并且腫瘤存在異質性，即腫瘤組織內部的腫瘤細胞并不是完全一樣的，各個腫瘤細胞從基因型到表現型均存在差異，并由此導致腫瘤細胞的生長速度、侵襲能力差異較大，且對抗腫瘤藥物的敏感程度也有所不同［18］。長期采用一種方式進行腫瘤治療很容易造成腫瘤的多藥耐藥，從而失去治療效果。而根據腫瘤異質性設計更精準的治療方法組合才能發揮最大的療效、產生最小的毒副作用，避免多藥耐藥的發生。基于此，發展一種協同治療體系來進行腫瘤治療是十分必要的。

光熱治療是利用納米材料優異的吸光能力將光能轉換為熱能，通過加熱病灶部位來達到殺傷腫瘤細胞目的的一種治療方式，其能夠通過“雙選擇”實現對腫瘤部位的特異性治療。首先，納米治療體系所修飾的靶向分子對腫瘤組織有特異性識別的能力，此為第一重選擇過程；其次，可以通過控制治療激光的照射部位、照射激光強度以及照射時間實現對腫瘤部位的特異性殺傷［19］，此為第二重選擇過程。因此，光熱治療具有高特異性和低毒副作用的優勢。MCN具有獨特的表面效應、超大的比表面積、良好的光熱轉換效率以及較好的生物相容性等物理化學性質，在腫瘤的化療/光熱協同治療領域潛力巨大［20］。

本文基于MCN為藥物運輸載體運載抗腫瘤藥物Res，同時選用FA-PEG-Lip包裹，構建了裝載Res的FA-PEG-Lip包裹MCN（FA-PEG-Lip@MCN/Res）納米體系。該納米體系能夠通過葉酸受體介導的靶向識別過程特異性進入葉酸受體陽性的腫瘤細胞。由于Res能通過氫鍵和疏水作用吸附在MCN的介孔結構內［21］，所以該納米體系能夠提高Res的水溶性、穩定性、生物利用度，從而提高Res的抗腫瘤治療效果。同時，利用FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系中MCN的高效光熱轉化能力，一方面可以提高腫瘤部位的局部溫度，進而直接殺死腫瘤，實現腫瘤的PTT；另一方面，光致升溫可以作為一種刺激信號，控制藥物在腫瘤部位定點釋放。此外，適度高溫也可以增加腫瘤組織對化療藥物的敏感性，實現化療、光熱作用效果的疊加，從而達到腫瘤的協同治療。細胞水平上以及動物水平上的試驗表明，該納米體系能夠實現高效的腫瘤化療/光熱協同治療?；谄鋬灝惖膮f同治療效果及良好的生物安全性，我們相信FA-PEG-Lip@MCN/Res納米體系有望應用于實際的臨床腫瘤治療。