鹽溶法分離純化鯉魚(yú)卵的卵黃高磷蛋白及其理化性質(zhì)的研究

李慧中，劉紅梅，李 彥，李秋雨，龔姚謙，戴 幽，劉 焱*

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 410128；3. 芷江侗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，芷江 419100；4. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

中國(guó)的水產(chǎn)資源種類繁多，魚(yú)卵作為魚(yú)副產(chǎn)物的一種，含有豐富的卵黃高磷蛋白（phosvitin, Pv），是仔魚(yú)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的唯一來(lái)源，對(duì)幼魚(yú)生長(zhǎng)至關(guān)重要［1-2］。研究表明，鯉魚(yú)卵中的不飽和脂肪酸含量甚高，且不飽和脂肪酸對(duì)于腦的發(fā)育和心血管疾病的治療具有重要作用［1］。多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFA）含量同飽和脂肪酸（saturated fatty acid, SFA）含量以及單不飽和脂肪酸（monounsaturated fat, MUFA）含量的比值在鯉魚(yú)卵中約為1:1:1，已達(dá)到人體脂肪酸含量的科學(xué)攝入標(biāo)準(zhǔn)，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)副產(chǎn)物的加工利用已有大量研究［3-7］，但關(guān)于魚(yú)卵Pv方面的相關(guān)研究甚少。以鯉魚(yú)卵為原料提取Pv有利于提高鯉魚(yú)魚(yú)卵的利用價(jià)值，減少資源浪費(fèi)。本研究擬采用鹽溶法提取鯉魚(yú)卵Pv，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究，這對(duì)鯉魚(yú)卵Pv在食品工業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟鯉魚(yú)卵采自湖南長(zhǎng)沙馬王堆農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。用生理鹽水將完整的鯉魚(yú)卵處理干凈后用高速勻漿機(jī)對(duì)其進(jìn)行勻漿處理（15 000 r/min）；雞蛋Pv標(biāo)樣購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鯉魚(yú)卵Pv的提取工藝

用4℃蒸餾水稀釋預(yù)處理后的鯉魚(yú)卵［V（蒸餾水）: m（鯉魚(yú)卵）=10:1］并在低溫下進(jìn)行1 h不間斷的攪拌，靜置過(guò)夜（4℃），棄去上清液后高速冷凍離心，將沉淀與有機(jī)溶劑［V（95%乙醇）: V（正己烷）=1:3］按照1:10的體積比進(jìn)行萃取、過(guò)濾（濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑可分離脂類）處理，用1.74 mol/L NaCl溶液對(duì)過(guò)濾后的沉淀進(jìn)行溶解并攪拌、靜置、再過(guò)濾后進(jìn)行透析脫鹽以及冷凍干燥處理，最終產(chǎn)物即為鯉魚(yú)卵Pv粗提物。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先對(duì)鯉魚(yú)卵的Pv粗提物進(jìn)行提取［8-9］，經(jīng)天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（native polyacrylamide gel electrophoresis, Native-PAGE）以及磷蛋白染色檢測(cè)確定其分子量以及純度；用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE）檢測(cè)Pv亞基的數(shù)量和分子大小；然后對(duì)鯉魚(yú)卵Pv進(jìn)行純化，根據(jù)天然凝膠電泳測(cè)得的結(jié)果對(duì)鯉魚(yú)卵Pv粗提物溶液進(jìn)行超濾分離、真空濃縮、冷凍干燥，得到其純品樣品，保存?zhèn)溆茫?40℃）；最后分別檢測(cè)樣品中氮和磷的含量，計(jì)算氮磷含量比值和Pv得率，檢測(cè)紫外吸收特性、氨基酸含量及其螯合鐵離子的能力。

1.2.3 Native-PAGE

參照汪家政等［10-14］的試驗(yàn)條件并稍加調(diào)整：鯉魚(yú)卵Pv粗提物及雞蛋Pv標(biāo)樣的質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL，5%～10%分離膠，5%濃縮膠，注射上樣，4℃恒流電泳。

磷蛋白檢測(cè)方法：參照Sun等［15］的方法對(duì)凝膠進(jìn)行染色，然后用10%的磺基水楊酸溶液將染色的凝膠漂至蛋白條帶回顯清晰后終止。

電泳蛋白質(zhì)染色脫色方法：用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250、25%乙醇、8%冰醋酸對(duì)鯉魚(yú)卵Pv凝膠進(jìn)行染色，用7%的冰醋酸溶液脫色，待蛋白條帶回顯清晰后進(jìn)行掃描成像。

1.2.4 SDS-PAGE

SDS-PAGE工作溶液的配制參照Native-PAGE的制備方法，在部分溶液中加入離子去污劑SDS。12%分離膠，5%濃縮膠。對(duì)凝膠進(jìn)行掃描成像，并根據(jù)Marker計(jì)算其亞基分子量。

1.2.5 得率測(cè)定

純化后的Pv重量占原料總重的百分比即為其得率。

1.2.6 氮磷含量及氮磷含量比值（N/P）的測(cè)定

氮含量的檢測(cè)：依據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

磷含量的測(cè)定［16-18］：本試驗(yàn)原料屬于有機(jī)磷，擬先將其消化為無(wú)機(jī)磷，再用未消化的原料做對(duì)比。磷蛋白絡(luò)合磷的含量=總的磷量－未消化原料中無(wú)機(jī)磷的含量。

1.2.7 紫外吸收檢測(cè)

將鯉魚(yú)卵Pv、雞蛋Pv標(biāo)樣分別配制成0.5 mol/L的溶液，并測(cè)定其光吸收特性（波長(zhǎng)：190～300 nm［19］）。

1.2.8 氨基酸組成檢測(cè)

用1 mL pH為2.2的檸檬酸鈉緩沖液溶解鯉魚(yú)卵Pv，用自動(dòng)分析儀分析除胱氨酸、色氨酸外的16種氨基酸［20］。其中色氨酸含量的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 18246-2000［21］。

1.2.9 鐵離子螯合能力測(cè)定

參照Fu等［22］介紹的方法測(cè)定鯉魚(yú)卵Pv的鐵離子螯合能力。采用分光光度法測(cè)定其在波長(zhǎng)為562 nm處的吸光度值。用螯合效應(yīng)表示Pv對(duì)鐵離子的螯合能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，用Excel和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉魚(yú)卵Pv的Native-PAGE結(jié)果

圖1為在5%濃縮膠和10%分離膠時(shí)鯉魚(yú)卵Pv粗提物（泳帶2）與雞蛋Pv標(biāo)樣（泳帶1）的分離結(jié)果的對(duì)比。從圖1中可以看到，雞蛋Pv有2條清晰的條帶，對(duì)應(yīng)于Zhang等［23］發(fā)現(xiàn)的雞蛋Pv標(biāo)樣主要組分為α-Pv（α-phosvitin）和β-Pv（β-phosvitin）這一結(jié)果；鯉魚(yú)卵Pv粗提物經(jīng)過(guò)凝膠分離后顯示為P1、P2、P3 3條條帶，經(jīng)梯度凝膠電泳檢測(cè)，其分子量分別為53.0、34.0和16.0 kD，其中P2（34.0 kD）、P3（16.0 kD）條帶的染色結(jié)果為陽(yáng)性，應(yīng)為鯉魚(yú)卵的Pv。這說(shuō)明鯉魚(yú)卵同雞蛋相似均含有Pv成分，同時(shí)也具有異質(zhì)性。

根據(jù)Native-PAGE檢測(cè)結(jié)果超濾分離粗提物，用超濾管（50 kD）超濾透析除鹽后的Pv，真空濃縮濾出部分冷凍干燥后進(jìn)行下一步分析。

圖1 雞蛋Pv標(biāo)樣和鯉魚(yú)卵Pv粗提物的Native-PAGE結(jié)果Fig. 1 Native-PAGE results of Pv crude extracts from egg and carp egg1：雞蛋卵Pv標(biāo)樣；2：鯉魚(yú)卵Pv粗提物。1: Standard sample of egg yolk of Pv； 2: Crude extract of egg yolk of carp Pv.

2.2 鯉魚(yú)卵Pv的SDS-PAGE結(jié)果

圖2為鯉魚(yú)卵Pv的SDS-PAGE結(jié)果。泳帶1顯示鯉魚(yú)卵Pv分為6條條帶，分別為P2和P3的亞基。它們的分子量從大到小分別為98.0、96.0、33.0、20.0、17.7、和15.0 kD，且亞基分子量分布范圍大。由圖2可知，鯉魚(yú)卵Pv在15.0～33.0 kD之間有4條條帶，其分子量分別為15.0、17.7、20.0、和33.0 kD。這與文獻(xiàn)中藍(lán)鱈卵Pv在相同范圍內(nèi)具有5條條帶［24］和鱸魚(yú)卵Pv中有2條條帶（其分子量分別為14.0 kD和21.0 kD）［8］的結(jié)果不同，說(shuō)明魚(yú)的品種對(duì)其Pv的組成存在一定的影響，但不影響其在一定范圍內(nèi)亞基分子量和數(shù)量上存在的相似性。

圖2 鯉魚(yú)卵Pv的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 2 SDS-PAGE results of Pv carp egg1 ：鯉魚(yú)卵Pv ；2 ：蛋白marker。1. Egg yolk of carp Pv； 2: Protein marker.

2.3 鯉魚(yú)卵Pv得率、氮磷含量及其比值

圖3為制作的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其線性回歸方程為y=0.067x+0.002，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，說(shuō)明其線性關(guān)系良好。經(jīng)測(cè)定，鯉魚(yú)卵Pv的質(zhì)量濃度為8.56 μg/mL，其磷含量為4.28%。

表1中，鯉魚(yú)卵Pv的氮含量為11.74%，磷含量為4.28%，氮磷含量比值為6.07，與雞蛋Pv標(biāo)樣的氮磷含量比值2.49相比較高，說(shuō)明鯉魚(yú)卵Pv的純度比雞蛋Pv的純度低，這可能是因?yàn)轷庺~(yú)卵Pv磷酸化程度比雞蛋Pv磷酸化程度低。相比鯉魚(yú)卵Pv中0.40%的提取率，有研究表明雞蛋Pv粗提物的提取率約為0.78%，鯉魚(yú)卵Pv提取率低于雞蛋Pv。

2.4 鯉魚(yú)卵Pv的紫外吸收特征

由圖4可知，在波長(zhǎng)為190.0～350.0 nm時(shí)，鯉魚(yú)卵Pv的吸收峰分別在201.0 nm處和257.8 nm處出現(xiàn)，而雞蛋Pv標(biāo)樣僅在201.0 nm處出現(xiàn)吸收峰，鯉魚(yú)卵Pv吸收峰呈對(duì)稱狀且沒(méi)有雜峰出現(xiàn)，說(shuō)明鹽溶法分離提取的鯉魚(yú)卵Pv較純。在波長(zhǎng)為190.0～220.0 nm處鯉魚(yú)卵Pv和雞蛋Pv的光吸收趨勢(shì)整體是相同的，在201.0 nm（峰2）處均出現(xiàn)最高吸收峰，其主要是由共軛雙鍵肽鍵的作用導(dǎo)致的。與雞蛋Pv不同的是，鯉魚(yú)卵Pv在波長(zhǎng)為257.8 nm處出現(xiàn)吸收峰，這可能是由苯丙氨酸的作用導(dǎo)致的。苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，大部分在體內(nèi)經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機(jī)體糖代謝和脂肪代謝。結(jié)果顯示，鯉魚(yú)卵Pv中苯丙氨酸的含量高于雞蛋Pv，且兩者的紫外吸收特點(diǎn)不同，故反映其在氨基酸組成上也存在差異性。

表1 鯉魚(yú)卵Pv和雞蛋Pv成分比較Tab. 1 Comparison difference of Pv from egg yolk and carp egg yolk

圖3 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 The standard curve of inorganic phosphorus

圖4 鯉魚(yú)卵Pv和雞蛋Pv的紫外吸收?qǐng)DFig. 4 The result about UV absorption of Pv from carp egg yolk and egg yolka：鯉魚(yú)卵Pv ；b ：雞蛋Pv。a: Egg yolk of carp Pv； b: Egg yolk of Pv.

2.5 鯉魚(yú)卵Pv中氨基酸的組成分析

從氨基酸分析結(jié)果可以看出（表2），鯉魚(yú)卵Pv和雞蛋Pv中共檢測(cè)出17種氨基酸，其中含有7種人體必需氨基酸。鯉魚(yú)卵Pv中除賴氨酸外，其余6種必需氨基酸的含量均高于雞蛋Pv，這能夠更好地促進(jìn)Pv的形成。由于在Pv的氨基酸總量中，絲氨酸占56%，且80%以上的絲氨酸被磷酸化，因此絲氨酸和總氨基酸的比值可作為評(píng)判Pv中磷含量高低的依據(jù)。鯉魚(yú)卵Pv中絲氨酸的含量為24.2%，明顯高于所含其他種類氨基酸，但比雞蛋Pv中絲氨酸占總氨基酸含量的34.9%要低。這與Mecham等［24］的研究中提出的藍(lán)鱈卵Pv中14.6%的絲氨酸含量結(jié)果相近，說(shuō)明魚(yú)類Pv絲氨酸含量比雞蛋Pv低，也說(shuō)明了鯉魚(yú)卵Pv中較低的絲氨酸含量正是導(dǎo)致其Pv含量低的主要原因。

2.6 鯉魚(yú)卵Pv中鐵離子螯合能力的分析

鐵離子極易被氧化，能夠誘導(dǎo)自由基反應(yīng)，研究中常以鐵離子為代表評(píng)價(jià)Pv的金屬離子螯合能力。如圖5所示，在鐵離子濃度相同的條件下，鯉魚(yú)卵Pv的鐵離子螯合能力小于雞蛋Pv。乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）螯合鐵離子的能力最強(qiáng)。鯉魚(yú)卵Pv的鐵離子螯合能力小于雞蛋Pv的鐵離子螯合能力，這主要與鯉魚(yú)卵Pv絲氨酸含量少、磷酸化程度小有關(guān)。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外在對(duì)Pv的研究中多從雞蛋中獲取，魚(yú)類中以鮪魚(yú)、黑魚(yú)、鱸魚(yú)以及鯽魚(yú)魚(yú)卵較為常見(jiàn)，對(duì)鯉魚(yú)卵的提取研究很少。本文采用鹽溶法對(duì)鯉魚(yú)卵的Pv粗蛋白進(jìn)行了提取，并檢測(cè)到其粗提物中P2和P3為Pv，說(shuō)明鯉魚(yú)卵中含有Pv成分，且其同雞蛋Pv相似，具有異質(zhì)性（由P2、P3組成）；SDS-PAGE檢測(cè)到鯉魚(yú)卵Pv亞基分子量分布范圍大，且在一定范圍內(nèi)Pv的組成在亞基分子量和數(shù)量上的相似性不受魚(yú)類品種的影響；氨基酸測(cè)試結(jié)果顯示，在鯉魚(yú)卵Pv中檢測(cè)出的7種必需氨基酸中，除絲氨酸外，其余6種必需氨基酸的含量均高于雞蛋Pv中的含量，這有利于更好地促進(jìn)Pv的形成；鯉魚(yú)卵中含有的食物限制性氨基酸賴氨酸和蛋氨酸含量高，且其Pv含量高于多種魚(yú)類。

表2 鯉魚(yú)卵及雞蛋［25］Pv的氨基酸組成及含量Tab. 2 Amino acid composition and content of Pv in egg yolk of carp and egg yolk［25］

圖5 鯉魚(yú)卵Pv，雞蛋Pv和EDTA的鐵離子螯合能力Fig. 5 The iron chelating ability of egg yolk of carp Pv, egg yolk of Pv and EDTA

通過(guò)鹽溶法提取分離鯉魚(yú)卵的Pv，可一次性獲得成分較為全面的目的蛋白。有采用葡聚糖凝膠（Sephadex G-200）過(guò)濾層析分離提取Pv的方法研究，但其試驗(yàn)速度較慢，且得到的目的蛋白較為單一；也有采用Tris緩沖溶液的提取方法，但結(jié)果顯示其提取率遠(yuǎn)低于鹽溶法。綜合來(lái)說(shuō)，提取魚(yú)卵中的Pv宜采用鹽溶法。通過(guò)鹽溶法提取分離鯉魚(yú)卵的Pv并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行探究，對(duì)鯉魚(yú)卵在食品工業(yè)中的高值化利用存在實(shí)際意義。