缺乏運動降低成年人胰島素敏感性的加權基因共表達網絡分析*

劉會平 劉湘茹 李 智

【提 要】 目的 通過加權基因共表達網絡分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)分析久坐影響成年人胰島素敏感性的關鍵基因及其相關功能和機制。方法 針對下載于NCBI的人類基因表達匯編(gene expression omnibus，GEO)數據庫的數據集GSE9103，利用WGCNA進行模塊化分析，并通過相關性分析和網絡可視化確定模塊內關鍵hub基因及其調控網絡，再對關鍵hub基因進行基因本體GO分析和基因集富集GSEA分析。結果 通過構建共表達網絡，最終得到5個基因模塊，其中yellow模塊與久坐呈正相關，而NDUFA9為其樞紐基因；tan模塊與久坐呈負相關，而MYBPC2為其樞紐基因。進一步對GO和GSEA分析發現，yellow模塊基因包括NDUFA9主要發揮線粒體形成、有氧呼吸、脂肪酸降解等生物學功能并參與物質代謝、三羧酸循環、阿爾茨海默氏癥、帕金森病相關通路；而tan模塊基因包括MYBPC2則與骨骼肌收縮、糖原代謝、心臟發育相關。結論 本研究通過構建基因共表達網絡篩選出與久坐生活方式顯著相關的2個關鍵基因模塊和2個樞紐基因；這2個模塊基因分別通過線粒體功能、物質代謝和骨骼肌收縮、糖原代謝而影響成年人對胰島素的敏感性。

胰島素敏感性降低是導致肥胖、代謝綜合癥、糖尿病、高脂血癥等多種慢性疾病的重要臨床問題，隨著年齡的增長，其發生風險顯著增加。線粒體功能障礙表現為線粒體還原酶活性、蛋白質合成和表達以及DNA(mtDNA)豐度的下降，多見于上述人群[1]。已有報道顯示，在老年、2型糖尿病患者和肥胖者以及2型糖尿病患者的后代等群體內，胰島素敏感性與肌肉線粒體功能密切相關。肌肉線粒體功能障礙是產生胰島素敏感性下降甚至胰島素抵抗的重要影響因素[2]。也有研究表明，久坐的生活方式引起顯著的胰島素抵抗，定期運動可提高胰島素敏感性，均與年齡無關，但有研究發現老年人較年輕人具有顯著的線粒體功能障礙[3]。因此，有必要進一步針對久坐的生活方式引起胰島素敏感性下降的具體機制進行深入研究。

本研究利用加權基因共表達網絡分析(WGCNA)，從大量基因中篩選與久坐的生活方式密切相關的樞紐基因，結合對基因模塊的基因本體分析和基因集富集分析，進行功能注釋，探討久坐的生活方式較定期運動更可能引起胰島素抵抗的相關分子機制與調控網絡。

資料與方法

1.數據集和研究對象

本研究分析的數據集GSE9103下載于NCBI的GEO數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。該研究納入的40名健康人中，老年人(59～76歲)20人，年輕人(18～30歲)20人。久坐組研究對象(10名老年人、10名年輕人)的運動時間每周少于2次，每天少于30分鐘；而運動組研究對象(10名老年人、10名年輕人)在過去至少4年的時間內每周運動6天且每天騎車或跑步至少1小時。研究對象均需填寫業余時間活動調查表，并經過病史、體檢、分級跑步機測試、血化驗(如血脂、激素水平、血糖檢測)的篩選。有代謝性疾病或心血管疾病病史、血糖>99mg/dl、體重指數>28kg/m2、應用影響研究測量結果的藥物、貧血、妊娠、藥物/物質成癮濫用者被排除。基因組數據的獲得方法如下：研究對象經過一次分級跑步機測試，此后7天內嚴格控制飲食與運動，并在測試后第630小時利用局麻下經皮細針穿刺取腓腸肌活組織(約350～400mg)進行基因組分析。詳細信息參見已發表論文[3]。

2.基因數據的獲得

提取研究對象腓腸肌活組織中的總RNA并應用Human Genome U133 Plus 2.0 進行基因表達微陣列分析，獲得該數據集series matrix數據，以方差最大的探針為基本單位進行后續分析。

3.基因共表達網絡構建與關鍵樞紐基因的篩選

利用R軟件的WGCNA工具包，構建基因共表達網絡并篩選出與表型高度相關的基因模塊。再通過計算模塊中每個基因與該模塊(module membership，MM)的相關系數，篩選出核心基因(GS 絕對值>0.2，MM絕對值>0.8)，納入string數據庫(https：//string-db.org/)構建基因相互作用網絡，再利用Cytoscape和cytoHubba MCC法進行可視化分析與前10位關鍵作用基因的鑒定篩選。

4.基因GO與GSEA分析

Metascape 平臺基因注釋分析數據庫可對輸入基因進行基因本體(GO)分析。分別提交tan和yellow模塊包含的基因，輸入物種和分析物種均選擇為“H.sapiens”，設置P<0.01，進行 GO 分析，保存結果，并按照每個條目涉及的靶點數目進行排序，篩選排名靠前的生物過程和通路，采用 GraphPad Prism 7.0 軟件對結果可視化。

應用Gene Set Enrichment analysis 3.0版軟件，以hubgenes的表達值為表型，先后以MSigDB在線基因集數據庫的KEGG/ GO gene sets作為參考基因集，對基因表達譜進行基因集富集分析(GSEA)。隨機組合次數設置為1000次。以P<0.05，且FDRq<0.25為具有統計學意義。

5.統計分析

WGCNA[4]基于兩個假設：表達模式近似的基因可能接受共調控或處于同一通路；表達網絡符合無尺度分布。由此根據表達相似性，將基因劃分為不同模塊并找出樞紐基因。進行WGCNA之前，首先進行數據預處理，構建N×M矩陣(N=樣本數，M=基因數)。通過層次聚類方法，去除離群樣本。基于pickSoftThreshold函數篩選軟閾值構建鄰接矩陣和拓撲矩陣，以使基因分布符合無尺度網絡。根據相異度對基因進行聚類，使用動態剪切法將聚類樹剪切為不同模塊，以每個模塊的第一主成分基因為特征向量基因。根據表型與特征向量基因的相關性挖掘相關性P值最小且具有統計學意義的模塊。通過計算模塊所包含基因的內部連接度篩選出樞紐基因。

結 果

1.基因模塊與核心基因鑒定

共5000個基因用于WGCNA。以鄰接矩陣權重參數(軟閾值)β=16、每個基因網絡模塊最少的基因數目為30作為標準，最終獲得black、blue、greenyellow、tan和yellow 5個模塊，以|MM|>0.9和|GS|>0.2為參數篩選出其核心基因分別為GORASP2、LINC00491、S100A4、MYBPC2和NDUFA9。再根據各個模塊的特征向量，分別計算模塊與 2 個表型(久坐和定期運動)的相關性。如圖1所示，yellow模塊(400個基因)與久坐呈正相關(COR=0.53)，而tan模塊(30個基因)與久坐呈負相關(COR=-0.62)。

圖1 與定期運動相比，久坐者共篩選出5000基因與久坐顯著相關的基因模塊與核心基因

2.yellow模塊樞紐基因網絡分析

將yellow模塊的樞紐基因上傳string數據庫，利用cytoscape進行網絡可視化，并利用cytohubba插件的MCC方法篩選出前10位基因，包括ATP、MRPL、NDUF家族等在共表達網絡和蛋白相互作用網絡皆重要的關鍵作用基因(圖2)。

圖2 分析明確久坐相關的基因與yellow模塊基因顯著相關并進行網絡可視化篩選yellow模塊的前10位關鍵基因

3.yellow模塊樞紐基因的功能分析

如圖3和表1所示，yellow模塊基因行GO分析顯示其具有線粒體形成、有氧呼吸、脂肪酸代謝等生物學功能如mitochondrial envelope/matrix/respiratory chain complex III，aerobic respiration，fatty acid degradation/beta-oxidation using acyl-CoA dehydrogen等。進一步KEGG分析則富集了KEGG_OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION、KEGG_CITRATE_CYCLE_TCA_CYCLE、KEGG_PORPHYRIN_AND_CHLOROPHYLL_METABOLISM、KEGG_ALZHEIMER_DISEASE、KEGG_PARKINSONS _ DISEASE等與糖脂代謝、三羧酸循環、阿爾茨海默氏癥、帕金森病密切相關的信號通路。

圖3 Metascape平臺對yellow模塊基因進行GO分析明確其生物學功能

表1 久坐者骨骼肌中顯著上調且與NDUFA9共表達的yellow模塊基因的GSEA分析

4.tan模塊樞紐基因網絡分析

tan模塊中，與MYBPC2密切相關的蛋白包括多種能夠調節骨骼肌功能、減少細胞凋亡、抑制炎癥、調節血脂代謝和抑制血管新生等的蛋白質，如：GLRX、PHKA1、NIBAN1、CYP27A1、TNNI2、CD38、TNNT3、ATP2A1、PPP1R3D、CASQ1、MTHFD2、ANKRD23、TNFRSF1A等(圖4)。

5.tan模塊樞紐基因的功能分析

tan模塊基因行GO分析富集了調節骨骼肌收縮、糖原/蛋白代謝、凋亡、氧化還原酶活性及心臟發育等生物學功能(圖5)。KEGG分析按本研究標準未能成功富集信號通路。

圖4 分析明確久坐相關的基因與tan模塊基因顯著相關并進行網絡可視化篩選tan模塊的關鍵節點基因

圖5 Metascape平臺對tan模塊基因進行GO分析明確其生物學功能

討 論

據報道，yellow模塊的代表基因如ATP、NDUF和MRPL家族蛋白分別具有調節線粒體呼吸鏈功能和線粒體內蛋白質合成的生物學功能，是影響線粒體形成和功能的重要因素。其中，ATP5F1B、ATP5MC3和ATP5ME編碼的蛋白為線粒體合成酶的重要亞基，對線粒體合成ATP具有重要的調節作用。已有研究表明，上述ATP家族蛋白表達升高與肥胖、高血壓[5]、血脂代謝異常[6]、胰島素抵抗[7]、2型糖尿病、腎積水、惡性腫瘤侵襲特性和轉移耐藥等臨床問題密切相關[8]。NDUFA9 和NDUFS2編碼的蛋白質分別是NADH脫氫酶復合體的疏水蛋白部分和核心亞基，NADH脫氫酶復合體是位于線粒體內膜的電子傳輸鏈中的第一個酶復合物。因此，NDUF家族蛋白對調節線粒體呼吸鏈功能具有重要作用。NDUF家族蛋白可引起新生兒Leigh綜合征、惡性腫瘤的轉移潛能、視神經病變、早發精神分裂癥等臨床問題[9-10]。MRPL15和MRPL41編碼的蛋白質是線粒體核糖體蛋白，有助于線粒體內蛋白質的合成。二者的臨床報道很少，目前發現其表達增加與ER陽性的乳腺癌相關[11]，而相對較多的基礎研究主要發現其與細胞周期抑制和凋亡相關[12]。本研究利用骨骼肌標本的基因組學分析發現，與定期運動相比，久坐的生活方式導致上述基因增加，并發現其通過發揮促進線粒體的形成、呼吸鏈、脂肪酸降解、細胞色素C釋放、輔酶A水解等功能調節糖脂代謝、三羧酸循環、阿爾茨海默氏癥、帕金森病相關通路。因此，上述基因及其調節的相關通路，可能是久坐患者發生胰島素抵抗的重要機制，其對胰島素抵抗以及相關疾病的影響值得深入研究。

另一方面，久坐者的MYBPC2基因顯著低表達。該基因編碼的是快速型蛋白肌球蛋白結合蛋白C，與肥厚性心肌病的發生、發展相關[13]。本研究發現的MYBPC2網絡互作蛋白中，GLRX編碼蛋白催化谷胱甘肽還原反應，在抗氧化防御系統中發揮重要作用[14]。PHKA1編碼磷酸化酶激酶，異常可引起糖原貯積病[15]。CYP27A1編碼細胞色素P450超家族蛋白，催化涉及藥物代謝和膽固醇，類固醇和其他脂質合成的許多反應，對于調節膽固醇的體內平衡非常重要[16]。TNNI2編碼快縮肌蛋白，參與組成肌鈣蛋白復合體，調節骨骼肌與血管平滑肌功能，還具有抑制腫瘤發生發展的作用[17]。TNNT3、ATP2A1、ANKRD23及CASQ1均參與骨骼肌收縮與功能的調節[18-20]。PPP1R3D編碼絲蘇氨酸蛋白磷酸化酶，而TNFRSF1A編碼腫瘤壞死因子超家族蛋白，二者均具有廣泛的調節作用，參與多種細胞生物學活動如細胞生存、凋亡和炎癥等[21]。本研究發現tan模塊中MYBPC2及其網絡互作蛋白在久坐者體內較規律運動者顯著減低，可能為久坐者的骨骼肌收縮、糖原代謝等活動減低的適應性反應，但同時可能是引起胰島素抵抗的重要機制。

本研究通過對基因數據集GSE9103進行基因組學WGCNA分析，針對定期運動者與久坐者的基因表達譜，構建了與久坐密切相關的基因共表達網絡，并對核心樞紐基因及其功能機制進行了多重分析，從基因水平上揭示了缺乏運動導致胰島素抵抗的發生機制，對于探討胰島素抵抗以及相關疾病的調控機制和靶點具有重要意義。