續斷種子方對少精子癥模型小鼠精子發生的影響?

何 明，王權勝，蒙帥杰，蔣 越，王東珊，楊德芬

(1. 廣西中醫藥大學， 南寧 530001； 2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院， 南寧 530023)

據統計資料顯示，約50%的不孕不育由男方原因引起[1]。男性不育的原因很多，如生精功能障礙、輸精管梗阻、附件腺功能缺陷、遺傳或環境因素等[2-3]，其中生精功能障礙是男性不育的主要原因[4]。精子發生是一個極其復雜的過程，主要可分為有絲分裂期、減數分裂期和生殖期3個階段。生精細胞凋亡和分化在精子發生過程中發揮著重要作用[5]。細胞增殖和凋亡之間的動態平衡決定了睪丸曲細精管中的細胞數量。在精子發生的整個過程中受到一系列激素的影響，其中睪酮在精子發生過程中起重要作用，精子發生缺乏睪酮會導致精子生成不足[6]。“續斷種子方”源于明·岳甫嘉《醫學正印》“補腎健脾益氣種子煎方”。前期研究表明，續斷種子方對精子具有抗氧化酶活性和減少氧化損傷作用，可提高精子質量[7-8]，是改善男性精子質量的有效藥物，但其潛在的機制尚不清楚。因此，本實驗基于精子發生的睪丸微環境，探索續斷種子方對生精功能障礙模型小鼠精子發生的調節作用及其機制。

1 材料

1.1 主要儀器

MACRO精子計數板和WLJY-9000型偉力彩色精子質量檢測系統(購自北京偉力新世紀科技發展有限公司)；TDL-4ZB型低速自動平衡離心機(購自湖南星科科學儀器有限公司)；掃描電子光學顯微鏡，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院病理科提供。

1.2 主要試劑與藥物

環磷酰胺粉針劑(批號K1625007，購自阿拉丁公司)；TUNE試劑盒(產品號11684817910, 購自北京中杉金橋生物技術有限公司)；血清睪酮放射免疫試劑盒(批號S10940111，購自天津九鼎醫學生物工程有限公司)。

續斷種子方藥物組成：續斷15 g,杜仲 15 g,骨碎補15 g,菟絲子15 g,牛膝15 g,枸杞子10 g,女貞子10 g,黨參15 g,白術10 g,山藥15 g。采用單味中藥配方顆粒(免煎中藥，由江蘇省江陰市天江藥業有限公司生產，產品批號1203002)，維生素E膠丸，生產廠家為桂南藥業股份有限公司(產品批號VE180402)。

1.3 動物

45只雄性小鼠，6～8周齡，體質量24～28 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，動物許可證號[SCXK(桂)2009-0002]。小鼠飼養于廣西中醫藥大學動物房，均自由采食飲水，隔日換水，3 d更換1次墊料，環境溫度20～25 ℃，12 h明暗周期。適應性飼養1周后隨機選取10只作為正常對照組，另外35只造模成功后按照隨機數字表法分為模型組、續斷種子方組、維生素E組各10只。本實驗已通過廣西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查(批準號2017JJA10462)。

1.4 造模方法

模型的制備方法參考文獻[9]，除對照組以外的小鼠均采用環磷酰胺以0.9%生理鹽水5 ml稀釋后，分別按2 mg/d[80 mg/(kg·d)]的劑量造模，連續腹膜內注射5 d。此法先前已被證明可誘導精子發生功能障礙[10]。同時對照組注射等量0.9%生理鹽水。各組小鼠正常喂養4周后，隨機抽取模型組小鼠5只處殺,取下左側睪丸及附睪，光學顯微鏡下附睪精子檢測和組織病理學中見少量精子，提示少精子癥動物模型造模成功。

2 方法

2.1 干預方法

造模成功后稱動物體質量，按人體等效劑量將藥物配成水溶液劑型灌胃給藥。模型組和對照組小鼠給予0.9%生理鹽水灌胃；續斷種子方組小鼠每天給予9 g生藥量/(kg·d)，濃度為1 g/ml的續斷種子方溶于生理鹽水中灌胃，維生素E組小鼠(黃油溶液)每天給予75 mg/(kg·d)，濃度為5 mg/ml的維生素E膠囊溶于生理鹽水中灌胃，每日1次，連續8周。

2.2 取材方法

末次給藥24 h后將小鼠稱重，各組所有小鼠行標本眼眶采血檢測血清睪酮。然后頭頸脫臼法處死小鼠迅速取出睪丸和附睪，生理鹽水沖洗，除去血液將睪丸或附睪的質量除以體質量計算睪丸、附睪相對質量用于評價小鼠生長發育狀態。將小鼠一側睪丸和附睪分別固定于Bouin溶液中24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟切片包埋，行HE染色。另一側附睪置于含2 mL培養液小皿中剪碎, 36.5 ℃孵育使精子充分游離泳動30 min,做精液質量分析。

2.3 精液全自動檢測

采用精子計數板和精子檢驗系統檢測精子濃度和活動力,按WHO《人類精液檢查與處理實驗室檢驗手冊》[11]標準測定精子參數。

2.4 放射免疫法檢測

將血清以3000 r/min分離15 min，取上清液置于-40 ℃冰箱，采用睪酮測定試劑盒對血清睪酮水平進行檢測。

2.5 HE染色

睪丸和附睪組織切片行蘇木精伊紅(HE)染色,每組制作10張切片,每張切片隨機取2個視野觀察(×200,即每組觀察20個視野),計數類圓形生精小管上皮層次、類三角形或類菱形間質細胞團內細胞數。記錄顯示嚴重低細胞性(生精細胞數減少)和生精上皮變薄的受損小管，附睪組織(×400, 每組觀察20個視野)觀察附睪管精子濃度和早熟精子數量。

2.6 TUNEL法檢測

按試劑盒說明書操作,顯微鏡下生精細胞核和細胞質中染成棕黃色顆粒者為細胞凋亡陽性表達,每組制作5張切片,每張切片隨機取5個視野觀察(×100,即每組觀察25個視野),計數生精細胞凋亡陽性率。每張切片計數每個生精小管內凋亡陽性細胞各占所有生精細胞的比率(即凋亡陽性率),連續觀察5個生精小管斷面計數凋亡陽性率。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 造模后體征和行為表現

小鼠出現飲水和進食減少、自主活動減少、毛發干枯、精神不振、耳廓蒼白、上瞼下垂無力、反應遲鈍等癥狀，1周后上述癥狀逐漸好轉。在造模中因體質量和劑量計算誤差出現死亡2只(模型組1只，續斷種子方組1只)，灌胃過程中因血管破裂、刺破胃及食管等原因致大鼠死亡2只(維生素E組1只，模型組1只)。

3.2 續斷種子方對小鼠體質量、睪丸附睪相對質量、精子質量、生精小管受損的影響

表1示，生殖器官的相對質量和精子參數是常用于監測男性生殖系統的損害指標。與對照組比較，模型組小鼠睪丸相對質量、精子濃度和精子活力顯著下降，受損生精小管增加(P<0.01)；與模型組比較，續斷種子方組小鼠睪丸相對質量、精子濃度和精子活力顯著增加，受損生精小管減少，差異有統計學意義(P<0.01)，體質量、附睪相對質量無明顯變化。

表1 續斷種子方對小鼠體質量、睪丸附睪相對質量、精子質量、生精小管受損的影響

3.3 續斷種子方對小鼠血清睪酮、間質細胞、生精上皮層數的影響

表2示，與對照組比較，模型組血清睪酮、生精上皮層數顯著降低(P<0.01)，間質細胞數值變化不明顯；與模型組比較，續斷種子方組血清睪酮、生精上皮層數均增加(P<0.01)。

表2 續斷種子方對血清睪酮、間質細胞、生精上皮層數水平的影響

3.4 睪丸組織病理學

圖1示，在正常對照組中可見睪丸的正常組織學特征，如生精上皮層正常厚度，有大量生精細胞和間質細胞(圖1A)。相反，模型組小鼠表現出排列松散萎縮的曲細精管，變薄的生精上皮細胞，特別是在減數分裂階段生精細胞脫落增多和少量的間質細胞減少(圖1B))。在維生素E組中，盡管生精上皮變薄，但在生精小管中可見許多成熟的精子細胞(圖1C)。在續斷種子方組中，生精上皮層變厚，不同階段的精子細胞排列分布，在曲細精管中可見許多成熟的精子細胞，此外續斷種子方治療組中的間質細胞數增加(圖1D)。

3.5 附睪組織病理學

圖2示，正常對照組附睪組織的精子濃度正常，早熟精子細胞很少(圖2A)。模型組精子濃度降低，附睪尾部的曲細精管中早熟精子細胞的數量增加(圖2B)。續斷種子方組和維生素E組均能改善精子濃度，降低附睪尾部早產精子細胞數量(圖2C)和(圖2D)。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.維生素E組；D.續斷種子方組圖中黑色箭頭指示早熟精子圖2 光鏡顯微鏡下各組小鼠附睪尾組織切片比較(HE染色×400)

3.6 生精細胞凋亡陽性率比較

圖3示，特異性免疫組織學染色c-kit陽性信號是細胞質、細胞核內的棕黃色顆粒,染色陰性為未著色細胞或僅可見棕黃色，陽性細胞即為凋亡細胞。在光鏡顯微鏡下(×100)可看到，細胞凋亡大多發生于精母細胞和精原細胞。模型組 (12.54±2.88)%，維生素E組(6.46±2.19)%，續斷種子方組(2.71±2.13)%，與模型組比較，續斷種子方組凋亡陽性率顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.維生素E組；D.續斷種子方組(圖中黑色箭頭示凋亡細胞)圖3 光鏡顯微鏡下各組小鼠睪丸組織切片比較(HE染色 ×100)

4 討論

少精子癥是男性不育癥中最常見的類型，其發病機制尚未完全清楚，是目前男性不育研究的熱點之一。根據2017年歐洲泌尿外科學會公布的數據顯示，男性不育患者中少精子癥比例呈上升趨勢[12]。我國不孕不育率已高達15%，其中由男方引起的不育約占50%[13]。內分泌激素異常是導致男性不育或生育力低下的主要原因之一[14]。前期臨床實踐及實驗研究均證實，續斷種子方可提高精子質量[7-8，15]。本實驗進一步探索續斷種子方促生精功能障礙模型小鼠精子發生的潛在機制。

環磷酰胺作為烷化劑，是引起生精功能障礙的因子之一。在本研究中，成年雄性小鼠腹膜內注射環磷酰胺5 d后可誘導生精功能障礙，能直接引起大量精原細胞和精母細胞凋亡,干擾生精細胞增殖和分化，從而阻礙生精細胞有絲分裂,導致精子數量生成減少[10]。有研究報道，環磷酰胺可通過增強Bax基因的表達誘導間質細胞大量凋亡,睪酮分泌減少,最終導致生精上皮細胞凋亡[16]，精子數量減少。研究發現，注射環磷酰胺可明顯降低小鼠精子濃度及活動，引起睪丸附睪的組織學損傷。在模型組，可見小鼠睪丸組織曲細精管萎縮明顯，生精上皮變薄，生精細胞和間質細胞明顯減少。相反，續斷種子方組經治療后睪丸相對質量、精子濃度和活動力顯著增加，睪丸組織生精上皮層變厚，間質細胞數量增加，分泌高水平睪酮。與模型組比較，續斷種子方治療后可明顯增加附睪管中精子濃度和活力，減少附睪管中早熟的精子細胞。研究表明，續斷種子方組可明顯修復環磷酰胺所致小鼠睪丸組織的損傷，促進精子發生。

睪酮是精子發生的主要調節因子，通過與雄激素受體(AR)結合起作用。睪酮自間質細胞分泌后，可經支持細胞進入生精小管轉變為雙氫睪酮，與生精細胞的雄激素受體結合促進精子生成。在缺乏睪酮或AR功能失調的情況下，精子發生在減數分裂過程中將會停滯，使少數生殖細胞發育到單倍體精子細胞階段和細長精子細胞階段后不能發育為成熟精子[17-19]；另外，附著到圓形精子或方形精子的間質細胞不能維持生殖細胞營養，使精子細胞過早成熟[20]，形成畸形精子、少弱精子；此外，在沒有睪酮信號傳導的情況下，成熟的精子細胞被支持細胞保留和吞噬[17]，精子減少。模型組小鼠睪酮水平的低下可能是由于睪丸及附睪組織損傷、間質細胞數量分泌減少所致；續斷種子方組小鼠間質細胞數量增多，睪酮明顯升高，生精細胞凋亡陽性表達明顯減少。有研究報道，睪酮水平升高可抑制生精細胞凋亡，促進精子發生，二者有密切關系[21]。因此課題組認為，續斷種子方提高模型小鼠精子濃度機制可能與增加間質細胞數量，分泌高水平睪酮，抑制生精細胞凋亡，促進精子發生有關。

中醫多從“腎虛”“脾腎兩虛”“肝腎同源”論治男性不育癥。通過文獻研究和臨床經驗總結，課題組認為“營氣不從，腎精虧虛”是男性不育癥的主要病因病機，“營氣不從”即指睪丸附睪局部氣血不足。《黃帝內經》云：“邪之所湊，其氣必虛”。睪丸局部氣血不足，營衛失和，血管通透作用失調，血郁熱聚，經絡阻隔，日久腎子失養則不育，治以“健脾益腎，活血生精”的續斷種子方。該方源于明·岳甫嘉《醫學正印》“補腎健脾益氣種子煎方”,岳甫嘉[22]認為此方乃“蓋精神氣血，皆脾土所化生。此方得種子生息之元，生精最速，陽事易舉，若能節欲，生子更易。真方之王道而神奇者”。“續斷種子方”由續斷、骨碎補、杜仲、牛膝、菟絲子、枸杞子、女貞子、黨參、白術和山藥組成，方中續斷、黨參補腎生精、健脾補血；枸杞子、菟絲子、女貞子補腎生精、益氣活血；牛膝、紅藤、杜仲、骨碎補活血通絡、補腎生精；山藥、白術健脾益氣、生精固精，諸藥合用共奏健脾益腎、活血生精通絡功效。藥理研究表明，枸杞子、菟絲子含有總黃酮類物質，可以提高睪酮激素水平，抑制生精上皮細胞凋亡，同時具有清除自由基、抗氧化損傷作用[23-24]。女貞子含有大量微量元素Zn，可刺激生精細胞增殖，增加間質細胞數量，為精子發生和成熟提供條件[25]。續斷、杜仲可降低睪丸組織中的活性氧，減少睪酮的合成和DNA損傷，達到抗自由基損傷功效[26-27]。牛膝能抑制精索靜脈血管內皮細胞的增殖，有效預防脂多糖對精子的損傷[28]。

本研究表明，續斷種子方促進少精子癥模型小鼠精子發生的機制可能為，通過改善睪丸微環境，增加間質細胞數量，分泌高水平睪酮，抑制生精細胞凋亡，從而促進精子發生。但升高的睪酮抑制生精細胞凋亡的機制以及是否通過基因調控來實現，尚有待進一步探討。