補陽還五湯預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠抗氧化功能的影響?

宋忠陽，陳玉嬋，雍文興，張志明△，劉永琦，張利英，張衛強

(1. 甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，蘭州 730000； 2. 甘肅中醫藥大學定西校區，甘肅 定西 743000；3. 甘肅中醫藥大學附屬醫院，蘭州 730000； 4. 甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，蘭州 730000)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球范圍內高發的重大心血管疾病之一，具有高死亡率和致殘率的特點。近年來，對于AMI的治療雖取得較大的進展，但其死亡率仍高居不下，究其原因主要是現代醫學發展中出現的以溶栓、急診經皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)為代表的治療方法，雖然能開通閉塞血管，挽救瀕死心肌，但在減少急性心肌梗死面積的同時，由于冠狀動脈的驟然開通與血流恢復引發的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)[1]又成為AMI治療新的困難與挑戰，因此減少MIRI成為AMI治療的關鍵。目前中醫藥防治MIRI已成為AMI治療及基礎研究的新方向。臨床研究表明，中醫藥對于MIRI的防治具有療效穩定、副作用少等優勢[2]。補陽還五湯出自清代名醫王清任的《醫林改錯》，該方的主要作用是益氣補血、活血化瘀、疏通心脈。大量臨床研究證實[3-4]，補陽還五湯對于諸多心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、心絞痛、心力衰竭、心律失常等有較好的療效，能夠有效改善MIRI患者的心功能，降低患者血清炎癥細胞因子水平。現代研究發現，該方能夠清除氧自由基，抑制鈣超載，改善血管微循環[5]。

鑒于此，本研究擬運用補陽還五湯預處理，采用結扎冠狀動脈左前降支(LAD)的方法建立MIRI大鼠模型，觀察補陽還五湯對大鼠血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、血清超氧化物歧化酶(SOD) 及一氧化氮(NO)含量的影響，從實驗角度探討補陽還五湯對MIRI心肌的保護作用，為進一步揭示和研究補陽還五湯治療心血管疾病的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

取健康清潔級成年Wistar大鼠40只，雌雄各半，7～8周齡，體質量(240±20)g，均由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(甘)2015-0002。大鼠飼養于甘肅中醫藥大學實驗中心SPF級實驗室，標準顆粒飼料及潔凈飲用水喂養，飼養環境為晝夜各半交替，溫度19 ℃～24 ℃，通風良好，濕度恒定。本實驗已通過甘肅中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批(倫理審批號IACUC2016-039)。

1.2 藥品

補陽還五湯根據《醫林改錯》所載原方的藥味配藥，劑量每錢以3 g換算。具體藥量：生黃芪120 g(購于隴西保和堂藥業有限責任公司，生產批號20190802)、當歸尾6 g(購于隴西保和堂藥業有限責任公司，生產批號20191106)、赤芍4.5 g(購于隴西縣徵鑫藥業有限責任公司，生產批號1903005)、地龍3 g(購于甘肅中天藥業有限責任公司，生產批號20003080)、桃仁3 g(購于甘肅弘潤藥業有限公司，生產批號20200301)、紅花3 g(購于甘肅神農文峰藥業有限公司，生產批號20190801)、川芎3 g(購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司，生產批號D2006005)，經過煎煮濃縮后藥物濃度為3 g/ml，放置于4 ℃冰箱貯存備用。以上藥物均由甘肅中醫藥大學附屬醫院中藥制劑室加工提供。

1.3 儀器設備及試劑盒

HX-100E型小動物呼吸機，成都泰盟科技有限公司；Powerlab數據采集分析系統，埃德儀器國際貿易有限公司；7020型全自動生化儀，日本日立公司；VE1OCITY 18R型低溫高速離心機，DYNAMICA公司；UTL1386-3-U43型低溫冰箱，Thermo Scientific公司；TN-100B型托盤天平，上海第二天平儀器廠；UV-3000型紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司；LDH、CK、MDA、SOD、NO試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司(Jiangsu Meimian industrial Co., Ltd)，產品批號1809R。

1.4 方法

1.4.1 分組及干預 40只Wistar大鼠隨機分為4組各10只。Sham組LAD只穿線不結扎； MIRI組LAD結扎30 min，復灌120 min；缺血預適應組LAD結扎10 min，復灌10 min，反復3次，然后結扎30 min，復灌120 min；補陽還五湯組LAD結扎30 min，復灌120 min； 其中劑量參照《藥理實驗方法學》[6]中人鼠等效劑量換算，按人體體表面積的0.018倍計算得出。補陽還五湯組給予15 g·kg-1· d-1的藥物灌胃，Sham組、MIRI組、缺血預適應組給予等量生理鹽水灌胃，各組均以每日1次灌胃，連續7 d。

1.4.2 造模 課題組前期已進行大鼠MIRI模型的改進[7]，具體過程如下：大鼠術前禁食不禁水12 h，稱重標記。10%的水合氯醛(0.3 mL·100 g-1) 腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，頸部、胸前手術備皮，碘伏消毒，鋪無菌孔巾。連接Powerlab數據采集分析系統，記錄標準Ⅱ導聯心電圖，有異常者剔除。切開頸部氣管接人工呼吸機進行輔助呼吸(潮氣量5 mL/100 g，頻率60～80次/min，呼吸比為2∶1，給予呼氣末持續正壓呼吸)。胸骨左側0.5 cm 處以第3、4肋骨作為上下邊界縱行剪開皮膚約3 cm，用鑷子及手術刀鈍性分離皮下組織、胸大肌直至肋間肌，用彎止血鉗將皮膚和肌肉夾起固定于兩側，于心肌搏動明顯處縱行剪開3/4肋骨，用撐開器撐開胸腔，用眼科鑷夾破心包膜暴露心臟，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間找到左冠狀靜脈主干，LAD與之伴行，在棉簽的協助下擠出心臟，用眼科縫合線在左心耳下緣與肺動脈圓錐間距主動脈根部約2 mm處進針,進針寬度及深度均在2 mm左右，穿線后于左冠狀靜脈主干上置一自制小塑料管(管中間剪一小孔，方便固定)結扎。結扎成功后肉眼見左心室前壁變青紫或蒼白，搏動減弱，心電圖示ST段抬高(≥0. 25 mV)為心肌缺血標志。結扎30 min 后用剪刀將結扎線剪斷形成再灌注，心電圖顯示ST段逐漸下降50%左右。造模結束后，按層次依次縫合胸腔、肌肉、皮膚，碘伏消毒，術后腹腔注射少量青霉素預防感染。

1.4.3 觀察指標 心電圖(ECG)ST段的變化：通過記錄大鼠ECG在結扎30 min內和再灌注120 min內的ST段變化情況，觀察補陽還五湯對MIRI模型大鼠心電圖ST段的影響。生化指標測定，造模結束后腹主動脈采血4～5 ml，置于高速冷凍離心機(3000 r/min，溫度-10 ℃)中離心15 min，取上清液2～3 ml置于EP管中，-20 ℃冰箱冷藏，然后按照試劑盒說明書步驟依次測定血清中LDH、CK、SOD活性和MDA及NO含量。采用ELISA法檢測血清LDH和CK的活性，采用硫代巴比妥酸法血清MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定血清 SOD活性及硝酸還原酶法測定血清NO含量。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 補陽還五湯對MIRI模型大鼠心電圖(ECG)ST段的影響

2.1.1 模型評價結果 圖1示，根據ECG觀察，Sham組大鼠在實驗過程中ECG無明顯波動，MIRI組大鼠在結扎缺血30 min過程中及再灌注120 min內，其心電圖Ⅱ導聯ST段與Sham組比較均有明顯抬高(P<0.05)，表現為明顯的缺血狀態，說明造模成功。

注：A.結扎前(正常心電圖)；B.缺血時段；C.再灌注時段圖1 大鼠MIRI不同時段心電圖表現比較

2.1.2 MIRI各階段大鼠心電圖ST段變化情況比較及各組典型心電圖表現 表1圖2示，與Sham組比較，MIRI組、缺血預適應組、補陽還五湯組大鼠在結扎缺血30 min過程中及再灌注120 min內其心電圖Ⅱ導聯ST段均有明顯抬高(P<0.05)；與MIRI組比較，補陽還五湯組、缺血預適應組大鼠ECG在結扎缺血30 min內與MIRI組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但隨著再灌注時血流的恢復，即再灌注120 min時間段內，MIRI組、補陽還五湯組和缺血預適應組大鼠ECG 的ST段均下降，以補陽還五湯組和缺血預適應組下降最為明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。補陽還五湯組與缺血預適應組比較，2組大鼠ECG在整個過程中比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 各組大鼠典型心電圖表現

表1 各個階段MIRI模型大鼠心電圖ST段變化比較

2.2 補陽還五湯對MIRI模型大鼠LDH、CK、SOD活性、MDA及NO含量的影響

表2示，與Sham組比較，MIRI組大鼠血清中LDH、CK活性及MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性、NO含量明顯降低(均P<0.05)。與MIRI組比較，補陽還五湯組和缺血預適應組大鼠血清中 LDH、CK活性及MDA含量均明顯降低(P<0.05)，血清中SOD活性、NO含量顯著升高(均P<0.05)。

表2 再灌注后各組大鼠LDH、CK活性比較

3 討論

MIRI是AMI治療的重要環節之一，隨著現代醫療技術的進步和發展，溶栓、PCI等治療技術能有效地開通血管，減少心肌壞死的發生，但血管的驟然開通會引發新的心肌損傷，因此如何在有效應用現代醫療技術的同時，最大程度地減輕所導致的二次創傷問題成為本領域研究的熱點。研究表明[8]，中醫藥在MIRI的防護方面擁有豐富的經驗和獨特的優勢，故探索和挖掘中醫方劑在防治MIRI中的作用成為目前血管疾病研究的重要方向。

AMI屬于中醫學“胸痹”范疇，臨床表現以胸痛、胸悶、氣短、乏力等癥狀為主，病位在心脈。早在《素問·痹論篇》載：“心痹者，脈不通。”《重訂靈蘭要覽》：“氣血不虛則不滯，既虛則鮮有不滯者，所以作痛。”《金匱要略》：“胸痹而痛，所以然者，責其極虛故也”，說明氣虛血瘀、本虛標實是胸痹的基本病機，治療當以益氣活血為主[9]。本研究所選的方劑補陽還五湯出自清·王清任的《醫林改錯》，是益氣活血法的代表方劑。大量臨床研究證實，補陽還五湯能治療諸多心血管疾病，如心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、心絞痛、心力衰竭、心律失常等，臨床應用廣泛，療效顯著[10]。補陽還五湯藥物組成主要有黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、紅花、桃仁、川芎。根據“氣旺而促進血行，血暢則絡脈通”的中醫理論，本方重用黃芪大補脾胃之元氣，當歸尾活血不傷血，佐以赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍以通經活絡、活血祛瘀，所有藥物合而用之則有補氣活血、祛瘀通絡之效[11]。現代藥理研究發現，補陽還五湯能夠改善微循環和血流動力學，具有抗炎、調節免疫的作用[12]。

MIRI機制較復雜，主要原因有氧自由基增多、鈣超載、能量代謝障礙、血管內皮炎性損傷和細胞凋亡等[13]。本實驗選擇缺血預適應組作為補陽還五湯的陽性對照，是根據Murry[14]提出的缺血預適應理論，即多次反復的短時間(2-10 min)缺血會讓心肌產生耐受，對心肌產生自我保護作用。這種保護效應可持續1～3 h，進而延緩心肌細胞的損傷和凋亡。Murry認為，對于MIRI的防護可以從內源性保護機制入手，其機制可能與缺血預適應能夠拮抗MIRI的發生因素(自由基增多、鈣超載、能量代謝障礙、血管內皮炎性損傷和細胞凋亡等)有關，從而達到保護心肌的目的。當MIRI發生時，機體的一過性活性氧(ROS)急劇升高，使得心肌細胞發生氧化損傷，導致心肌細胞凋亡或死亡。機體的氧化防御酶，如SOD是清除這些氧自由基的重要抗氧化相關酶類，SOD活性的高低能夠反映機體的抗氧化能力[15]。MDA是細胞膜脂質過氧化產物，MDA含量高低反映了氧自由基在細胞內生成水平及其對細胞的損傷程度[16]。NO是血管內皮細胞在NO合酶(NOS)作用下合成并釋放的一種作用強大的內皮源性舒張因子(EDRF)，具有抗氧化的作用，再灌注期血管內皮發生炎癥反應、鈣超載等會導致NO含量降低[17]。本實驗結果顯示，補陽還五湯能夠增加再灌注期SOD活性和NO含量，降低MDA濃度，說明補陽還五湯能夠清除再灌注期內過多的ROS，減輕細胞膜脂質過氧化反應，防護再灌注期心肌細胞的氧化應激損傷，減少MIRI對心肌細胞的損傷。LDH、CK的活性水平是反映心肌細胞損傷程度的有效指標[18]，再灌注期心肌細胞受到氧化損傷，導致細胞膜通透性增加，心肌酶通過細胞膜進入血中，使血清中LDH、CK活性升高。本實驗結果顯示，補陽還五湯能夠降低心肌酶LDH、CK的活性，證明補陽還五湯能夠減少心肌酶向細胞膜的外漏，保護心肌細胞膜的完整性。

綜上所述，在結扎30 min和再灌注120 min時間段，MIRI組大鼠心電圖Ⅱ導聯ST段均明顯高于Sham組，表現為明顯的缺血狀態，證明造模成功。補陽還五湯預處理組和缺血預適應組在整個實驗過程中，大鼠心電圖、心肌酶等其他抗氧化指標差異均無統計學意義。本實驗一方面證實補陽還五湯對MIRI大鼠心肌組織具有保護作用，其機制與減輕細胞膜脂質過氧化反應，防護再灌注期心肌細胞的氧化應激損傷有關。另一方面，以 Murry提出的缺血預適應理論中拮抗MIRI的發生因素為線索，通過補陽還五湯組與缺血預適應組作對照，證實缺血預適應能夠增加心肌對缺血的耐受，引起MIRI大鼠心肌酶、抗氧化指標發生相應變化，減緩心肌細胞的凋亡，對心肌亦有一定的保護作用。關于其對血管內皮細胞炎癥反應、鈣超載等炎性指標及有關分子通路機制有待課題組的進一步研究探討。