剁辣椒中一株乳酸菌的分離與鑒定

周維成，卞杰松，劉 晶，蔡明基，楊鈞惠，李曉平，楊德俊

（1. 湘南學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 郴州 423000；2. 湖南省嘉禾縣三味 食品有限公司，湖南 郴州 423000）

剁辣椒是湖南的特色食品，酸辣可口，深受消費者喜愛。剁辣椒主要利用天然乳酸菌進行發(fā)酵，一方面發(fā)酵速度慢，另一方面品質(zhì)的形成受自然條件的影響非常大，常因為自然條件的變化而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)發(fā)生變化[1]。因此，篩選高效、耐鹽、耐酸同時具有較強亞硝酸鹽降解能力的優(yōu)良乳酸菌進行純種發(fā)酵，成為提高剁辣椒發(fā)酵品質(zhì)的重要途徑。目前從剁辣椒中分離出的發(fā)酵菌主要是植物乳桿菌、短乳桿菌、戊糖片球菌等，但以乳桿菌為主。葉陵等[2]從12 份剁辣椒樣品中分離出乳酸菌，用產(chǎn)酸、亞硝酸鹽降解率等指標(biāo)篩選出優(yōu)良的乳酸菌，并對其進行鑒定，然后進行耐鹽、耐酸能力的比較。隨后，葉陵等[3]以篩選到的優(yōu)良植物乳桿菌W-4 作為發(fā)酵菌株進行純種發(fā)酵，觀察發(fā)酵過程中剁辣椒中微生物菌群及有機酸的變化規(guī)律，進一步闡明植物乳桿菌在剁辣椒發(fā)酵過程中的作用機制。胡博涵等[4]采用乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵的方式生產(chǎn)剁辣椒，研究其適宜發(fā)酵條件，為縮短發(fā)酵周期，提高剁辣椒品質(zhì)做出了相關(guān)貢獻。郭蓉等[5]也從剁辣椒中分離出一株乳酸菌，在接種發(fā)酵過程中相比其他乳酸菌亞硝酸鹽含量低。徐浩等[6]篩選出一株耐鹽在24%以上的酵母菌，經(jīng)鑒定為魯氏結(jié)合酵母。

目前，以人工接種方式進行剁辣椒工業(yè)化生產(chǎn)尚處于起步階段。為了使傳統(tǒng)產(chǎn)品在工業(yè)化過程中仍能保持其特色，筆者擬從剁辣椒中篩選出優(yōu)良乳酸菌菌株，通過研究其生長繁殖與代謝特性，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，為剁辣椒工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

剁辣椒來源于湖南省郴州市嘉禾縣三味食品有限公司；MRS 培養(yǎng)基購自北京索萊寶，其他試劑均為分析純（均購于國藥化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠）；pH 值計（E-301F pH 三復(fù)合電極，雷磁）；紫外可見分光光度計（UVmini-1240，島津）；電子恒溫水浴鍋（HH-2，蘇州威爾實驗品有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101 型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；離心機（TDZ5-WS，湘儀）；PCR 擴增儀（MiniAmp Plus，賽默飛世爾）；電泳儀（DYCP-31BN，北京六一生物科技有限公司）；紫外凝膠成像儀（BOT-III，中儀博騰）

1.3 試驗方法

1.3.1 剁辣椒中乳酸菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察 無菌條件下，取10 g 剁辣椒溶于100 mL 無菌生理鹽水中，搖勻，經(jīng)系列稀釋后涂布MRS 固體平板中，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落至新的MRS平板上進行劃線純化，將純化的單菌落進行保存。對分離菌落進行革蘭氏染色并鏡檢。

1.3.2 分子鑒定 取適量菌液，CTAB 法提取DNA。利用16s rRNA 通用引物5F：ATGAACGCTGGCGGTA TG，819R：TTCCTTTGAGTTTCACAGTTGC 進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系：12.5 μL Taq MasterMix（康為世紀(jì)），10 μmol/L 上下游引物各1 μL，1 μL 總DNA，補無菌水至25 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物切膠回收，連接pMD18-T 載體（Takara，Japan），測序。在NCBI 中進行BLAST 序列比對分析。利用Mega 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 生長曲線的測定 將活化菌株按2%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，每4 h 于紫外分光度計下測定600 nm 處培養(yǎng)基吸光值。

1.3.4 耐酸性試驗 將活化的乳桿菌分別接種于pH值為3、5 和7 的MRS 培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h，每隔4 h 測定600 nm 處吸光值。

1.3.5 亞硝酸鹽降解率測定 取2 mL 活化菌液，接種 至100 mL 含有100 mg/L NaNO2的MRS 培養(yǎng)基中， 37℃搖床培養(yǎng)24 h后，離心取上清按照GB/T 5009.33— 2003 測定培養(yǎng)基中NaNO2濃度。

1.3.6 耐鹽性試驗 配制不同鹽濃度（0、5%、7%、10%、12%和15%）的MRS 培養(yǎng)基，分別接種等量2%的活化菌液，37℃搖床培養(yǎng)24 h，測定600 nm 處吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌的分離與鑒定

挑取單菌落進行多次劃線后，菌落形態(tài)呈圓形，表面光滑，白色。對純化后的菌株進行革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陽性菌株（圖1 a），菌體呈桿狀。16s rRNA 序列比對后發(fā)現(xiàn)該菌株與植物乳桿菌（L. plantarum）最為相近（圖1 b），NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST比對顯示與L. plantarum 的相似性可達99.9%，因此將分離獲得的菌株命名為L. plantarum SW。

2.2 菌株生長特性

圖1 分離菌株形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)育樹

SW 菌株在MRS 液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖2，接種0～8 h 內(nèi)，菌株生長較緩慢，隨后菌體生長速率快速增加，24 h 后菌株數(shù)量相對緩慢，培養(yǎng)32 h 時菌株數(shù)量達最大值，隨后，菌株數(shù)量開始下降。

2.3 不同pH 值對菌株生長的影響

不同pH 值條件下SW 菌株生長狀況見圖3，當(dāng)在pH 值為3 時，SW 菌株數(shù)量在整個培養(yǎng)周期內(nèi)無顯著變化，當(dāng)pH 值為5 和7 時，隨著pH 值的增加菌株增長速率加快。24 h 時，pH 值為7 時處理組菌 株生長速率相對pH 值為3 和5 時增加了57%和31%。

圖2 SW 菌株的生長曲線

圖3 不同pH 值條件下菌株生長狀況

2.4 菌株對亞硝酸鹽降解能力分析

隨著培養(yǎng)時間延長，SW 菌株對亞硝酸鹽的降解能力不斷增強（圖4），培養(yǎng)24 h 后含有SW 菌株的MRS 培養(yǎng)基中亞硝酸鈉含量下降至空白對照的21%，表明菌株SW 具有較強的亞硝酸鹽降解能力。

圖4 菌株對亞硝酸鹽降解能力

2.5 氯化鈉對菌株生長的影響

由圖5 可知，在不含氯化鈉培養(yǎng)基中SW 菌株生長狀況最好，隨著鹽濃度的升高，SW 菌株的生長速率逐漸減慢，當(dāng)氯化鈉濃度為15%時，SW 菌株的吸光值僅為0.57，同對照相比生長速率降低了53%。表明氯化鈉會抑制菌株SW 的生長。

圖5 不同氯化鈉濃度菌株生長狀況

3 結(jié)論和討論

傳統(tǒng)的菌種分離鑒定手段很難通過單一方式對菌株進行準(zhǔn)確鑒定，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)為研究微生物種類和組成提供一條準(zhǔn)確、高效的技術(shù)手段。形態(tài)學(xué)特征結(jié)合rDNA 測序的分析鑒定方法已成為菌種分離鑒定的主要方式。卿煜維等[7]利用16s rDNA 序列鑒定了4 株亞硝酸鹽降解乳酸菌。徐浩等[6]采用26s rDNA 測序法將分離的耐鹽酵母菌鑒定為魯氏接合酵母。潘睛等[8]在泡菜中基于通過16s rDNA 基因序列比較準(zhǔn)確鑒定了從泡菜中分離的12 株乳酸菌。筆者在研究了SW 菌株形態(tài)特征的基礎(chǔ)上，對其16s rDNA 基因進行測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終確定該菌株為植物乳桿菌。

剁辣椒發(fā)酵過程中，乳酸菌不僅可以降低發(fā)酵液pH 值，改善辣椒原始組織構(gòu)造，同時還可促進其風(fēng)味與色澤的形成。發(fā)酵液中的離子強度會隨著發(fā)酵時間的延長而變化，為了抑制雜菌的生長，發(fā)酵液往往含有大量鹽分，因此剁辣椒發(fā)酵過程中乳酸菌具有一定的耐鹽性。李梓銘等[9]在鹽坯辣椒中分離出一株可以在氯化鈉含量為18%的培養(yǎng)基生長的植物乳酸桿菌。這是因為植物乳桿菌與其他乳酸菌相比具有較多的植物多酚降解基因，具有更強的適應(yīng)環(huán)境脅迫的能力。葉陵等[2]比較植物乳桿菌與短乳桿菌后發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌具有較強的耐酸和耐鹽能力。筆者從剁辣椒中分離的SW 菌株在鹽脅迫條件下生長速率減慢，但在高鹽環(huán)境中仍可以生長，說明該植物乳桿菌具有一定的耐鹽能力。食品中硝酸鹽或亞硝酸鹽的含量過高，會造成高鐵血紅蛋白癥，嚴(yán)重時可引發(fā)人體窒息死 亡[10]。乳酸菌對亞硝酸鹽具有較強的降解能力，這主要歸功于乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生乳酸和一系列酶，同時乳酸菌還具有抑制亞硝酸鹽還原酶生長的功能。研究對分離的植物乳桿菌SW 進行亞硝酸降解試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較強的亞硝酸鹽降解能力。