湖南柑橘果皮總黃酮及橙皮苷含量分析

劉嘉麗，劉德明，王 丹，張 鴻，董新榮，童建華

（1. 湖南農業大學化學與材料科學學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農業大學資源環境學院，湖南 長沙 410128；3. 湖南農業大學生物科技學院，湖南 長沙 410128）

中國是世界柑橘產量大國，2018 年全國種植面積達到260 萬hm2，產量達到4 138.1 萬t[1]。國內柑橘的消費主要為鮮食（55%）、榨取果汁及罐頭加工（35%～40%）[2]，其中加工將產生占鮮重45%～60%的柑橘皮渣[3]。柑橘果皮富含黃酮類化合物[4]，有文獻報道柑橘果皮黃酮主要為多甲氧基黃酮[5-6]，也有研究[7-11]認為主要成分為橙皮苷。

橙皮苷（hesperidin）是一種二氫黃酮苷，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調節免疫力、防輻射、保護心血管等藥理活性[12]。橙皮苷在食品工業中，可用作抗氧化劑、食品添加劑、果蔬高效抗氧保鮮劑等[13]。橙皮苷主要從枳實中提取分離，國際市場前景廣闊。枳實為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培變種的干燥未成熟果實[14]。由于產量有限，近年來枳實的市場價格暴漲，尋求新資源成為人們關注的熱點。

分光光度法具有儀器易得、操作簡單、測定快速等特點[15-16]，在柑橘果皮提取物及應用的研究中廣泛使用[17-20]。因樣品顯色方式不同，分光光度法又嗑分為UV 直接比色法、堿顯色比色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色比色法等。但是從植物提取物中分析單一化合物含量最有效的方法是HPLC 法[21-22]。前期比較了橙皮苷（對照樣品）與柑橘果皮提取液在不同顯色方法下的紫外-可見光譜的最大吸收峰波長，認為直接比色法和堿液顯色比色法適用于總黃酮的檢測，與伍長春等[18]的研究結果一致。但考慮到NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法為黃酮含量測定的通用方法，故將該方法一起進行比較；另外，采用HPLC 法測定了柑橘果皮中橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷的含量，以期為柑橘果皮的資源化綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試柑橘果皮的產地、采摘時間及品種名稱等信息見表1，所用橙皮苷（批號為P06D9F77001，HPLC含量≥98%）、新橙皮苷（批號為Z31J6L2067，HPLC含量≥98%）、柚皮苷（H24N9Z75869，HPLC 含量≥98%）購于上海源葉生物科技有限公司，甲醇為HPLC 級試劑，其余為分析純，試驗用水為蒸餾水。

主要儀器：UV-9600 紫外可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器集團有限公司），KQ300-DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），TDL80-2B 離心機（上海安亭科學儀器產），TP-520A 電子天平（湘儀天平儀器設備有限公司），HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），ATY124 電子天平（SHMADZU），島津LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品溶液制備 稱取柑橘果皮樣品粉末0.5 g，加入20 mL 甲醇，在210 W 的功率下超聲提取30 min。過濾，收集濾液。濾渣再用同法提取一次。合并2 次濾液，用甲醇定容至50 mL。溶液以2 500 r/min 離心10 min。離心液置4℃儲存備用。

1.2.2 UV 直接比色分析方法 （1）對照品溶液制備。精密稱取橙皮苷對照品5.4 mg，用甲醇溶解[12]，定容于50 mL 容量瓶中，得橙皮苷對照品儲備液，濃度為0.108 mg/mL。（2）標準曲線繪制。吸取橙皮苷對照品儲備液0.5、1、1.5、2 和2.5 mL 于10 mL 帶塞比色管中，用甲醇定容，搖勻。于282 nm 下測定吸光值。以橙皮苷濃度（mg/L）對吸光度A 繪制標準曲線。（3）樣品測定。精密量取樣品溶液0.1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。按上法測定吸光值，以橙皮苷為標樣計算總黃酮含量。

1.2.3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯 色 比 色 法 （1）標準曲線繪制。吸取橙皮苷對照品儲備液0.5、1、1.5、2 和2.5 mL 于10 mL 帶塞比色管中，加入0.5 mol 5%NaNO2溶液，放置5 min。再加10%Al(NO3)3溶液0.5 mL，放置5 min。再加5%NaOH 試液2.5 mL，用去離子水定容至刻度線，搖勻，常溫下顯色15 min。于346 nm 下測定吸光值。以橙皮苷濃度（mg/L）對吸光度A 繪制標準曲線。（2）樣品測定。精密吸取50 μL 各樣品溶液，置于10 mL 比色管中，按上法操作測定吸光值，以橙皮苷為標樣計算總黃酮含量。

1.2.4 堿顯色比色法 （1）標準曲線繪制。吸取橙皮苷對照品儲備液1、1.5、2、2.5 和3 mL 于10 mL 帶塞比色管中，加入0.5 mL 10%NaOH 溶液，用水稀釋至刻度線，在60℃下水浴顯色30 min，流水冷卻至室溫，搖勻。于360 nm 波長下測定吸光值。以橙皮苷濃度（mg/L）對吸光度A 繪制標準曲線，得到線性回歸方程。（2）樣品測定。精密量取不同樣品溶液0.2 mL，置于10 mL 比色管中，按上法操作測定吸光值，以橙皮苷為標樣計算總黃酮含量。

1.2.5 HPLC 法 （1）液相色譜條件：InertSustain-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為0.1% 磷酸/水溶液，流動相B 為乙腈；梯度洗脫條件為0～ 25.00 min 20% B，25.00～25.10 min 20%～100% B，25.10～ 27.00 min 100% B，27.00～27.10 min 20% B，27.10～ 32.00 min 20% B；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；檢測波長283 nm；進樣量10 μL。（2）標準曲線繪制。配制系列濃度的橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷混合對照樣品溶液，在色譜條件下測定，以濃度（mg/L）對峰面積繪制標準曲線。（3）樣品測定。按上法操作測定峰面積，以標準曲線計算指標成分含量。

2 結果與分析

2.1 不同顯色方法測定柑橘果皮總黃酮的最大波長和線性方程

在200～900 nm 波長范圍內對橙皮苷及樣品的甲醇溶液、堿顯色溶液、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色溶液進行波長掃描，3 種方法的最大吸收波長分別為282、360 和346 nm。在最大吸收波長下，峰型對稱性及吻合性較好，適合進行含量測定。

在282 nm 下直接比色測定時，橙皮苷的濃度在 5.4～21.6 mg/L 范圍內與吸光度具有良好的線性關系， 線性回歸方程A1=0.015 3+0.031 39 C1（R2=0.999，n=5）。 堿顯色法在360 nm 波長下測定時，橙皮苷的濃度在 4.4～22.0 mg/L 范圍內與吸光度具有良好的線性關系， 線性回歸方程A2=-0.006 8+0.013 86 C2（R2=0.999，n=5）。 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色在346 nm 波長下，橙皮苷的濃度在8.8～26.4 mg/L 范圍內與其吸光值具有良好的線性關系，線性回歸方程A3=-0.064 5+0.049 93 C3（R2=0.995，n=5）。

2.2 不同顯色方法測定總黃酮含量的差異性

由表1 可知，顯色方法對柑橘果皮中總黃酮的分析結果有影響。這與柑橘果皮中的次生代謝產物結構有關。UV 直接比色法是在282 nm 波長下測定的吸光度，從分子結構來看，很多酚酸類在此波長下都會有吸收峰。因此，UV 直接比色法實際上測定的是提取物中酚酸類化合物的含量。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定的原理是含有鄰位羥基（或羰基）結構的物質與Al3+形成配合物而顯色。因此，該方法實際上測定的是具有這種結構的多酚或者黃酮化合物的含量。而堿顯色法測定的原理是利用二氫黃酮在堿性條件下轉化為查爾酮顯橙色，具有特殊的吸收波長。理論上來說，此法測定的是二氫黃酮的含量。但是，黃酮類化合物的分子中含有鄰二酚羥基或者3,4’-二羥基取代時，在堿液中不穩定，易被氧化而顏色由黃變深紅色[23]，對查爾酮的含量測定產生影響，這是否是測定結果偏高的原因，還有待進一步探討。總之，文獻中常用的比色法測定植物提取物中黃酮類化合物的含量時，均是相對比較的、一大類結構相似化合物的總量。雖然不同方法測定總黃酮含量的結果存在差異，但是，3 種方法測定的結果均提示湖南柑橘果皮含有豐富的黃酮類化合物，具有綜合利用價值。

表1 柑橘果皮中總黃酮的含量

圖1 HPLC 色譜圖

2.3 影響柑橘果皮總黃酮含量的因素分析

柑橘的品種、產地、采摘時間均影響果皮中總黃酮的含量（表1）。首先，柑橘品種。同一產地（澧縣）的柑橘皮總黃酮含量明顯高于臍橙皮總黃酮的含量，柑橘早熟品種與遲熟品種的果皮總黃酮含量也存在差異（但與采摘時間有關）。第二，采摘時間。1 號樣品和5 號樣品為同一品種柑橘，1 號樣品于10 月中旬采摘，是早熟品種剛好成熟的時期，而5 號樣品于11月下旬采摘，這個時期對于早熟品種來講果實過于成熟了。1 號果皮的總黃酮含量明顯高于5 號樣品，表明果實在適宜采摘時期總黃酮含量較高，過晚采摘會降低果實總黃酮的含量。第三，果皮干燥方式。柑橘果皮60℃烘干樣品（2 號）的總黃酮含量明顯高于曬干樣品（1 號）。60℃干燥的時間短，而10 月中旬的太陽溫和，干燥時間長，可能引起黃酮化合物的氧化分解。但干燥方式對臍橙果皮中總黃酮的含量影響小于柑橘果皮，這可能與臍橙果皮和柑橘果皮所含的二次代謝產物結構不同有關。

2.4 HPLC 法測定柑橘果皮中的橙皮苷含量

植物提取物一般為多種結構與溶解性類似的混合物，HPLC 分析技術在混合物單一成分的定量分析中展現出極大的優勢。進一步以橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷為對照樣品，通過HPLC 色譜條件的優化，有效實現了柚皮苷與橙皮苷的基線分離，混合對照樣品及柑橘果皮提取物的HPLC 色譜圖如圖1 所示，圖1A中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的相對保留時間分別為17.362、19.460、23.331 min。

按1.2.5 的色譜條件，橙皮苷濃度在18.50～129.50 mg/L 范圍內，積分面積（y）與濃度（x）具有良好線性關系，線性方程為y=20 140.2x-3 488.16（R2=0.999 9， n=5）。

如圖1B 和C 所示。湖南柑橘果皮樣品主要含有橙皮苷，不含新橙皮苷及柚皮苷。這與一些相關報道的國內柑橘果皮中橙皮苷含量高的結果基本一致。

2.5 影響柑橘果皮橙皮苷含量的因素分析

如圖2 所示，柑橘果皮中橙皮苷的含量也明顯高于臍橙和南豐蜜橘皮，柑橘果皮中橙皮苷的含量最高可到果皮干重的7%左右；同時，柑橘果皮中橙皮苷的含量還因產地及采摘時間（如1 號樣品明顯高于5號樣品）而存在差異。

3 結 論

紫外-可見分光光度法的測定結果表明，湖南柑橘果皮含有豐富的黃酮類物質。HPLC 分析結果表明，湖南柑橘果皮樣品不含柚皮苷和新橙皮苷，橙皮苷的含量最高可達到果皮干重的7%左右，是良好的橙皮苷資源。同時，柑橘果皮中總黃酮和橙皮苷的含量可能因品種、產地及采摘時間不同而存在差異。因此，柑橘果皮作為橙皮苷的資源利用時，需要對品種、產地及采摘時間進行綜合考察，以獲得最好的橙皮苷原材料。

圖2 HPLC 法測定不同樣品的橙皮苷含量