有機氯農藥微生物降解機理的研究進展

趙元添，馬 娟，張 瀾，田 坤，姚丹丹，劉 云，3

（1. 蘭州交通大學 環境與市政工程學院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國科學院 南京土壤研究所土壤環境與污染修復重點實驗室，江蘇 南京 210008；3. 污染場地安全修復技術國家工程實驗室，北京 100015；4. 甘肅省污水處理行業技術中心，甘肅 蘭州 730070）

我國是一個農藥生產和使用大國，其中以六六六（HCH）、滴滴涕（DDT）為代表的有機氯農藥占農藥總產量的60%［1］。目前，農藥污染問題越來越嚴重，我國山東半島土壤中DDT檢出率為100%［2］，遼東半島土壤中DDT殘留量為45.70 μg/kg，為山東半島的2.5倍。長三角地區土壤中DDT檢出率為91%，殘留量達119.85 μg/kg，HCH檢出率為60%，殘留量達15.79 μg/kg［3］。珠三角地區土壤中DDT殘留量為2.02～11.77 ng/g，HCH殘留量為1.83～16.58 ng/g，硫丹殘留量為0.07～9.47 ng/g［4］。雖然目前大多點位HCH、DDT濃度低于《土壤環境質量 農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）［5］規定的0.1 mg/kg，但依舊存在環境風險。

我國于1983年開始明令禁止生產和使用HCH、DDT等有機氯農藥，后來簽署的《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》正式將此類物質列為“持久性有機污染物（POPs）”。為消除氯代POPs對人類的危害，GILLHAM等［6］首次提出利用零價鐵的強還原性來修復氯代烴污染場地，展漫軍等［7］提出利用微生物修復有機氯污染場地，包括生物強化技術和生物刺激技術。相較于物理、化學修復方法，微生物修復技術在維持土壤理化性質、增加物種豐度、提高土壤肥力和降低修復成本等方面更具有優勢。

本文介紹了生物強化技術降解有機氯農藥的研究進展，闡述了其降解機理，概述了微生物刺激技術及其影響因素，并對未來的研究方向進行展望。

1 微生物強化技術

1.1 功能菌的篩選

污染場地經歷幾十年的“自然選擇”過程富集了大量高效的功能菌。QU等［8］在安慶市某廢棄農藥化工廠附近土壤中篩選出的PYR2菌株可降解多種DDT同分異構體。ITO等［9］在韓國某污染場地篩選出的好氧菌種紅球藻S1-1可在14 d內將硫丹硫酸鹽從12.25 μmol/L降解至2.11 μmol/L。WANG等［10］在七臺河市某五氯硝基苯（PCBN）污染場地篩選出Peudomonas putidaQTH3，該菌株可降解包括HCH、DDT同分異構體在內的13種有機氯農藥，14 d降解率為10.85%～42.51%，該菌胞內酶可在30 min內將有機氯農藥降解44.73%。

放線菌門的菌絲結構及孢子的繁殖方式使其在土壤中廣泛存在。目前已知具有生物活性的代謝產物45%由放線菌產生，其中34%的活性物質由放線菌門中的鏈霉菌屬產生［11］。RAIMONDO等［12］在阿根廷某污染場地中篩選出高效的放線菌群鏈霉菌屬的A2、A5、A11和M7。該菌群在含水率30%及甘蔗渣與土壤質量比為1∶9的條件下，14 d內可將2 mg/kg的林丹降解72.6%。FUENTES等［13］在智利圣地亞哥市某有機氯污染場地篩選出18株可降解有機氯農藥的功能菌，其中12種為放線菌，均可降解氯丹和林丹。

真菌具有疏水的表面結構，可吸附絕大多數有機氯農藥。BHALERAO等［14］在某農藥污染場地分離出16種真菌，通過高濃度的硫丹培養基以及平板稀釋法最終分離出一株可高效降解硫丹的黑曲菌，該菌可在12 d內將400 mg/L的硫丹完全降解。MACRO-URREA等［15］利用白腐真菌云芝降解三氯苯的3種同分異構體，7 d內1，2，3-三氯苯降解率達91.1%，1，2，4-三氯苯降解率達79.6%，但無法降解1，3，5-三氯苯。

1.2 微生物強化降解有機氯農藥

微生物強化又稱微生物投加，主要是向污染場地投加功能微生物，微生物直接或間接地利用污染物同時大量繁殖從而更好地修復污染場地。SALAM等［16］將CandidaVITJzN04接種到受林丹污染的花園土壤中，30 d內對初始質量濃度100 mg/kg的林丹降解率達87%，而在不添加微生物的條件下利用本地土著微生物和植物協同作用林丹降解率只有40%。ZHU等［17］添加了外源古菌和細菌，物種豐富度提高且加強了土壤中脫氯和氧化相關物種之間的聯系，進而增強了生物降解過程。EGOROVA等［18］采用新紅球菌wratislaviensisCh628處理HCH初始質量濃度為（238.7±4.9） mg/kg的污染土壤，70 d內微生物強化組HCH降解率為44.8%，而利用土著微生物的HCH降解率只有33.3%。PURNOMO等［19］發現單獨使用Pleurotus eryngii對初始濃度為12.5 μmol/L的DDT降解率為43%，而Rastonia pickettii可強化Pleurotus eryngii使DDT降解率升高至78%。ABBES等［20］將Advenella kashmirensisMB-PR注入無菌的DDT土壤中進行微生物強化，20 d內對初始質量濃度為1.29 mg/L DDT的降解率達98%。GAO等［21］發現Sphingobacteriumsp. DDT-6降解DDT的功能完全來自其質粒pDOD，用這種質粒強化土壤中的大腸桿菌TG I后，210 d內對初始質量濃度0.6 mg/L DDT的降解率為50.7%。

2 降解有機氯農藥的關鍵酶

酶是由活細胞產生的對其底物具有高度特異性與催化效能的蛋白質。微生物降解有機氯農藥需要多種酶，其中最重要的是脫鹵酶，而與這些酶相關的基因統稱為Lin基因［22］。MACRO-URREA等［15］通過添加專屬酶抑制劑確認細胞色素P450單加氧酶參與了三氯苯第一步的脫氯反應。以γ-六六六（γ-HCH）為例主要涉及的脫氯酶可分為脫氯化氫酶（LinA）、烷基鹵脫鹵酶（LinB）、谷胱甘肽S-轉移酶（LinD）及其他參與代謝產物降解的酶，如開環加雙氧酶（LinE）和馬來酰乙酸還原酶（LinF）等。

實驗表明，δ-HCH［23］、好氧條件下的DDT［8］及厭氧條件下的DDT［24］降解第一步都需要LinA參與催化反應，但未發現β-HCH和其他氯化有機化合物被其催化［23］。可能由于這個酶的選擇性作用在有機氯污染物的一個反式異構體斜對角線的氫原子和氯原子上［25］。唐曉文［26］通過對γ-HCH在LinA催化下的生物降解過程探究γ-HCH到1，3，4，6-四氯-1，4-環己二烯（1，3，4，6-TCDN）的反應，首先γ-HCH第一次脫氯化氫，脫氯產物被排出酶外完成自身結構的轉化，轉化后再次進入酶內完成第二次脫氯化氫，且第二次產生的能量大于第一次產生的能量，再次印證LinA在有機氯降解中的重要地位。

LinB屬于α/β水解酶的一種鹵代烷脫鹵酶，其主體是由八條鏈狀的且側面鏈接有α-螺旋的β-折疊結構、上部的一個小環和幾個α-螺旋結構構成的［27］，其主要活性位點是主體和上部這兩個結構。LinB催化的反應實質為水解過程［28］，這類酶催化的底物范圍較廣，但是會被1，2-二氯乙烷（1，2-DCA）和1，2-二氯丙烷（1，2-DCP）［29］及β-HCH等物質抑制。因此需要誘導微生物產生突變后的LinB，突變后的LinB可以降低1，2-DCA和1，2-DCP降解所需要的勢能勢壘［30］，也可以通過改變LinB的活性催化β-HCH降解［31］，進而消除抑制。

LinD的主要作用是催化含鹵基的苯環結構或環狀化合物與還原型谷胱甘肽結合而脫氯。研究發現，由大腸桿菌BL21合成的DsmH1和DsmH2與LinD屬于谷胱甘肽轉移酶系統發育樹的同一分支，兩種酶在谷胱甘肽作為輔酶時均可在體外參與百草敵降解中間產物3，6-二氯龍膽酸酯的脫氯反應［32］。除上述脫氯的相關酶外，還有許多酶催化有機氯農藥的降解過程，如經上述催化過程后會產生大量酚類物質，而苯酚好氧代謝降解的第一步是通過酚的羥基化酶催化產生鄰苯二酚［33］，鄰苯二酚又在LinE的作用下開環形成不飽和二羧酸［34］；PCP 4-單加氧酶參與由微生物Flavobacteriumsp.催化氧化五氯酚（PCP）的脫氯反應［35］。漆酶是一種含銅多酚氧化酶［36］，以氧氣為電子受體，以酚類物質為底物進行氧化還原反應。漆酶可在真菌細胞內合成［37］，如擔子菌、子囊菌、曲霉等［38］，可參與有機氯農藥中間體的降解。

3 生物刺激技術

生物刺激是向污染環境中添加電子供受體與微生物載體等物質，使微生物在復雜體系中生長、繁殖與表達。微生物修復效果受諸多因素影響，如pH、溫度、濕度、土壤的理化性質、污染物的性質及濃度、碳源、氮源、微生物載體、電子受體等。

3.1 電子供受體

降解有機氯農藥的微生物有好氧型和厭氧型。QU等［8］發現桿菌Chryseobacteriumsp. PYR2為好氧菌，可降解HCH、DDT及其多種同分異構體，30 d的降解率可達80%～98%。KATAOKA等［39］發現真菌總壯毛霉DDF在10 d內可降解90%的狄氏劑；包霉菌W8和Cm1-45在28 d內可降解70%的α-硫丹和50%的β-硫丹，該體系中氧氣在反應中作為電子受體，參與污染物降解過程。在厭氧條件下微生物完全礦化有機氯農藥比較困難，與厭氧相關的代謝基因或酶的報道較少［40］。有機氯農藥在厭氧環境下脫氯會伴有其他反應，如NO3-在反硝化菌的作用下被還原的同時促進了有機氯農藥的脫氯反應。申屠玨［41］研究發現，質量濃度0.06～0.31 g/L的NO3-對PCP的還原脫氯起促進作用，而質量濃度0.62～1.24 g/L的NO3-反而抑制PCP的還原脫氯。SUN等［42］也發現，質量濃度0.62～1.24 g/L的NO3-對氯丹、林丹、硫丹等殺蟲劑的脫氯有促進作用，質量濃度大于3.10 g/L時對微生物降解有抑制作用。CAO等［43］通過投加一定量的葡萄糖為反應提供電子降低氧化電位可解決這種抑制作用。

鐵的氧化還原過程也會影響有機氯農藥的降解。異化鐵還原細菌（Trichlorobacter thiogenes）和米氏脫硫單胞菌［44］（Desulfuromonas michiganensis）均可利用Fe3+作為電子受體產生磁鐵礦納米顆粒，其表面富集大量的羥基增強了Fe2+內部的電子密度，當多個吸附態Fe2+靠近目標污染物時可吸附有機氯農藥并促進其脫氯過程。納米Fe3O4顆粒具有較高的比表面積和載酶能力可作為環境修復材料［45］。YU等［46］通過微生物Penicilliumsp. yz11-22N2結合Fe3O4形成一種新型磁性生物材料，5 d內對8 mg/L的莠去津降解率達91.2%。ZHANG等［47］通過添加納米Fe3O4誘導了環境中優勢菌屬Delftia的富集，將三氯吡啶酚生物降解率提高15.7%。ABBAS等［48］利用Shewanella oneidensis還原煉鐵廢液中的Fe3+，該菌可在72 h內將80%的溶解態Fe3+還原成Fe2+，在有機氯農藥初始質量濃度為20 μg/L、廢液中鐵質量濃度為15 g/L時，對多種有機氯農藥的降解率為異狄氏劑85%、狄氏劑90%、硫丹91%、七氯92.3%、滴滴涕90%、林丹35.7%。XIAO等［49］利用Shewanella oneidensisMR-1還原萘酚綠B提供Fe2+，再添加硫代硫酸鈉使其還原提供S2-，在微生物作用下合成納米級FeS，而FeS具備還原脫氯的能力，經常用作環境修復材料。

有研究表明，在確保嚴格厭氧的條件下，當溶解氫質量濃度大于2 ng/L、甲酸根離子質量濃度大于90 ng/L、醋酸根離子質量濃度大于59 μg/L時，硫酸鹽還原菌（SRB）的活性開始變高且超過鐵還原菌的活性［50］。SRB通過使用硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽甚至是單質硫等物質作為電子受體來氧化氫氣或有機氯底物從而獲得能量。在乙草胺降解體系中添加硫酸鹽時，可使半衰期從15 d縮短至10 d［51］。質量濃度為0.48 g/L和0.96 g/L的SO42-均會對有機氯農藥的降解產生抑制作用，這可能與土壤本身的理化性質或氧化還原電位有關，最適宜的SRB氧化還原電位為-200 mV［52］。添加共基質如葡萄糖、乙醇、乳酸、甘蔗渣等均可刺激SRB活性，且不同共基質對硫酸鹽的消耗不同，乙醇對硫酸鹽的消耗最低，葡萄糖對硫酸鹽的消耗最高［53］。

按照熱力學原理［54］，當環境達到高度還原條件時，其他電子受體消耗殆盡，產甲烷菌的活性增強，即反應以產甲烷過程為主，雖然產甲烷菌一般不直接參與脫氯反應但可以提供厭氧條件。TARTAKOVSKY等［55］發現，產甲烷菌和厭氧污泥體系可將四氯乙烯完全降解，當四氯乙烯質量濃度為42 mg/L時，氯脫除率高達88%。產甲烷菌結合其他電子供體的刺激可獲得更好的脫氯效果。MIN等［17］通過不同電子供體的投加發現丙酮酸投加后脫氯效果好于甲酸、乙酸和乳酸。LIAN等［56］結合厭氧發酵技術和同位素標記法探究HCH轉化為甲烷的過程，發現當HCH質量濃度高于150 mg/L時會影響乙酰產甲烷菌的活性并抑制甲烷的產生，反應器運行期間不斷投加α-HCH、β-HCH和γ-HCH，發現除β-HCH外其他農藥均可降解，污染物礦化為CO2和甲烷，甲烷菌屬和梭狀芽孢桿菌目豐度在農藥投加后顯著增加［57］。

電子供體會影響微生物在土壤中的增殖和活性進而影響微生物對環境中有機氯農藥的降解效率。在實際工程中可通過添加外源營養或微生物載體等方式刺激微生物的活性。氫氣作為一類還原性較強的電子供體可在厭氧環境下通過微生物轉移電子至有機氯農藥以達到降解有機氯農藥的目的。

實際操作過程中需向污染場地中投加一些易被利用的有機物如葡萄糖、乳酸、醇等，再通過土壤中的厭氧微生物作用產生氫氣，最終達到降解污染物的目的。CHEN等［58］研究發現，加入檸檬酸和乳酸可顯著提高微生物對有機氯農藥的降解率，但加入葡萄糖會抑制PCP的降解。檸檬酸可提高微生物在土壤中的存活率和活性，檸檬酸和乳酸均顯著增加脫氯微生物豐度，而有一些微生物如脫鹵球菌、脫硫細菌不能依靠葡萄糖作為碳源增殖。RABENHORST等［53］研究表明，土壤中大多數共基質的添加可顯著促進DDT的降解，但葡萄糖、乳酸及甘蔗渣作為共基質促進效果不明顯，這是由于土壤中其他微生物會與功能菌競爭電子供體，因此添加外源碳源既可能產生抑制作用，也可能產生促進作用。柳勇［59］利用三價鐵與13種不同分子量的有機酸、有機碳等共基質降解PCP，發現基質的碳原子數、解離常數、還原度均顯著影響二價鐵的積累量和積累速率，基質添加后的pH是影響二價鐵積累量的主要因素，而二價鐵是影響PCP降解的關鍵［48］。

3.2 微生物載體

生物炭作為一種常見的土壤改良劑，一般由工農業廢棄物、植物、污泥等物質在相對較低的氧含量及一定溫度（300～900 ℃）條件下熱解而成［60］。生物炭的疏松多孔結構可提高土壤持水率，改善土壤透氣性。生物炭可作為微生物的載體，也可以為微生物提供碳源和微量元素，促進微生物的增殖。ALI等［61］將污泥、花生殼、水稻秸稈、大豆秸稈燒成生物炭，以3%（w）添加到污染土壤中，65 d后4種生物炭的生物刺激組相對于對照組對總有機氯農藥的降解率均提高60%以上。通過高通量測序結果可知，因生物炭的添加使土壤pH升高，耦合其他協同效應導致酸桿菌、綠彎菌豐度下降；其他類型菌如變形菌、黑體菌、放線菌等物種豐度均提高20%左右。除大豆秸稈生物炭外其他類型生物炭均可顯著提高土壤中溶解性有機碳的含量，在降低土壤生物毒性的同時提高微生物活性。生物炭生物刺激技術也有其弊端，首先在制備階段產生清潔能源的同時也產生溫室氣體；產生的液態生物油含有有機酸等物質，燃燒時具有腐蝕性。同時生物炭的使用周期以及長期使用是否會出現新的生物毒性仍需要進一步證實。ZHU等［62］研究顯示，玉米秸稈生物炭在厭氧環境下，特別是電子供體不足時與環境產生復雜的化學-微生物耦合作用，會對PCP的微生物降解產生抑制作用。XU等［63］研究表明：生物炭的添加會明顯抑制PCP的微生物降解，在好氧條件下，可促進功能微生物的增殖，但卻減少了微生物與PCP的有效碰撞；在厭氧條件下可提高微生物與污染物之間的電子轉移效率，但仍會抑制PCP的降解，相對好氧情況抑制程度較弱。因此，生物炭與土壤、微生物的關系仍需要進一步探索，將生物炭應用于有機氯農藥污染的環境修復還需要進一步研究。

甘蔗渣作為一種低成本的土壤改良劑，可提高土壤的孔隙率、碳氮比、濕度等。RABENHORST等［53］研究發現，添加10%（w）甘蔗渣可最大程度降解DDT及DDT降解中間產物，經甘蔗渣處理后優勢菌種以梭狀芽孢桿菌為主，相比未添加甘蔗渣的對照組發現了脫硫孢子菌、脫硫桿菌等微生物。ABHILASH等［64］研究表明，土壤中添加50%（w）甘蔗渣處理60 d能去除53%的林丹，且甘蔗渣的添加可提高土壤中微生物的活性，促進農藥的降解，通過吸附作用可有效阻止林丹在土壤中的遷移。

3.3 其他環境因子

土壤含水率會影響微生物的生物代謝過程。RAIMONDO等［12］發現某鏈霉菌菌群在含水率30%的土壤體系中對林丹的降解率顯著高于含水率20%的土壤體系；同時發現砂壤土、黏性土壤、沙土3種不同類型土壤中鏈霉菌菌群對有機氯的降解能力具有顯著差異，酶活在不同土壤中也受到了不同程度的影響。白腐真菌能高效降解有機氯農藥，產生的木質素過氧化物酶、錳過氧化氫酶、漆酶等可將污染物礦化成CO2［65］，N源濃度越高，菌絲球衰老的速率越快［66］；且高濃度的碳氮比可同時增加木質素過氧化物酶和錳過氧化氫酶的活性，進而提高污染物降解效率。土壤的pH和溫度也會影響酶的活性進而影響污染物的降解，細菌的適宜pH范圍是5～9，pH略大于7活性最好，30～40 ℃時酶活性最高［67］。對于DDT、林丹污染比較嚴重的南美國家或我國比較寒冷的地區會選擇一些適合在15 ℃以下生長的嗜冷型微生物，如Sphingobiums indicumB90A、Sphingobiums japonicumUT26［68］等。在實際修復中會選擇溫度比較適宜的季節，或采用通入加熱空氣的方式來調節溫度。

4 結語與展望

a）實際有機氯農藥污染場地往往伴隨著有機氯農藥、農藥中間體、有機溶劑、重金屬、抗生素、微塑料甚至納米材料的復合污染，因此處理有機氯農藥復合污染的微生物降解技術是未來一個發展方向。

b）微生物降解HCH、DDT等有機氯農藥的降解路徑研究較多，但是有機氯農藥及其中間產物的降解路徑尚不明確，依然需要后續的探究。降解產物的生物毒性及是否會形成二次污染依舊需要進一步探索。

c）微生物修復技術還需與基因工程相結合。外源菌種在新環境下很難存活，或生長緩慢，因此需要通過質粒技術，將高效微生物代謝相關的基因轉接到土著微生物的基因上，代謝基因的表達增強土著微生物的降解能力。

d）有機氯農藥污染場地存在復合污染，毒性大，單一的微生物處理技術很難發揮其作用，多種微生物處理技術的研發是有機氯農藥污染場地修復的發展方向。