廣西人群AURKC基因rs1008073和rs2302060位點遺傳多態性與畸形精子癥的相關性研究

劉中林，韋玉霞，龐曉霞，廖碧云，陳興鴻，楊鳳蓮，王俊利

(1. 右江民族醫學院附屬醫院生殖醫學中心，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫學院藥學院，廣西 百色 533000)

不孕不育已成為育齡夫婦的一個困擾，據統計，約有10%～15%的夫婦受到影響，且男性因素占30%～50%[1]。而畸形精子癥是導致男性不育的主要原因之一。近年來國外的一些學者研究發現，極光激酶C(AURKC)基因的多態性可能與男性畸形精子癥有關[2-4]。本研究采用SNaPshot基因分型技術，對廣西人群AURKC基因rs1008073和rs2302060位點進行分析，探討其與畸形精子癥的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年6月—2019年4月在右江民族醫學院附屬醫院男科就診的286例男性患者為研究對象，所有研究對象戶籍均為廣西，且近5年內常住廣西。分為畸形精子癥組(142例)和對照組(144例)。畸形精子癥組納入標準為：①患者正常形態精子百分率<4%，精液質量分析正常；②夫妻雙方共同生活超過1年，且性生活正常，在未避孕措施的情況下無法孕育。畸形精子癥組排除標準為：①排除有生殖器感染、損傷、精索靜脈曲張等影響精子形態的疾病[5]；②排除有吸毒、桑拿、嗜煙、酗酒、長期接觸鋁/輻射/油漆等患者[5-6]。對照組納入標準為：患者正常形態精子百分率≥4%，且其他精液相關檢查正常，有正常生育史、身體健康的生育體檢男性。排除標準：排除有不良嗜好和不良生活方式的患者，如酗酒、嗜煙、吸毒、長期熬夜等[5]。本研究經醫院倫理委員會批準，已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 精液相關檢查 根據 WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)標準[7]，使用西班牙SCA檢測精液質量，精子形態學檢查采用diff-quik染色方法。

1.2.2 全血標本采集及DNA提取保存 所有研究對象給予靜脈穿刺，采集靜脈血3 ml，注入EDTA-K2抗凝管。根據全血核酸(DNA)提取試劑盒說明書(亞能生物技術有限公司)提取全基因組DNA(離心柱法)，保存于-20℃，備用。

1.2.3 多重單堿基延伸PCR 基因分型由上海天昊生物科技有限公司進行分型，包括PCR引物合成、多重PCR反應、PCR產物純化、延伸產物純化、延伸產物測序。其中PCR反應循環程序為：第一步，95℃ 2 min；第二步，94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃延伸60 s，循環11次；第三步，94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃延伸60 s，循環24次；第四步，72 ℃再延伸2 min。PCR引物、延伸引物設計見表1、表2。

表1 rs1008073和rs2302060位點PCR引物

表2 rs1008073和rs2302060位點PCR延伸引物

1.3 統計學方法 統計軟件使用SPSS 22.0軟件，不符合正態分布的兩組計量資料間的比較使用非參數秩和檢驗，用M(Q25～Q75)表示。AURKC基因突變對畸形精子癥的相對風險度使用非條件Logistic統計分析。哈迪-溫伯格定律檢驗基因位點遺傳平衡。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般臨床資料 兩組間的精液質量參數、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，而正常形態精子百分率比較差異有統計學意義(P<0.001)，見表3。

2.2 AURKC基因 rs1008073、rs2302060位點基因分型結果 AURKC基因 rs1008073、rs2302060位點的 PCR 擴增產物片段大小分別為150bp、114bp。ABI3730XL電泳儀檢測AURKC基因SNPs分型結果顯示rs1008073位點存在CC、CG、GG基因型和C、G等位基因。rs2302060位點存在TT、TC、CC基因型和T、C等位基因。基因測序可以證實我們的SNP基因分型結果，見圖1、圖2。

表3 研究對象一般資料比較

注：①代表CC；②代表CG；③代表GG。圖1 rs1008073基因型

注：①代表TT；②代表TC；③代表CC。圖2 rs2302060基因型

2.3 AURKC基因rs1008073、rs2302060位點與畸形精子癥的關聯性 畸形精子癥組和對照組之間AURKC基因rs1008073、rs2302060位點的基因型和等位基因頻率分布如表4所示。畸形精子癥組基因型分布符合哈迪-溫伯格定律(rs1008073：χ2=1.103，P=0.294；rs2302060：χ2=1.837，P=0.175)。對照組基因型分布符合哈迪-溫伯格定律(rs1008073：χ2=0.063，P=0.803；rs2302060：χ2=3.330，P=0.995)。兩組兩個位點基因型經哈迪溫伯格平衡定律檢驗，P均>0.05，提示這兩組研究對象群體基因遺傳平衡，具有群體代表性。經非條件Logistic回歸分析，rs1008073和rs2302060位點的基因型和等位基因頻率在兩組間差異都無統計學意義(P>0.05)，見表4。

2.4 AURKC基因rs1008073、rs2302060位點單倍型分析 使用在線軟件SHEsis對rs1008073、rs2302060位點進行連鎖不平衡(LD)分析。結果顯示，rs1008073和rs2302060位點D′=0.992，r2=0.984，說明這2個SNP之間存在強連鎖不平衡，如圖3所示。根據SHEsis軟件結果，AURKC基因rs1008073、rs2302060位點存在CT、GC、CC和GT共4種單倍型，但兩組間這4種單倍型的頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表4 兩組AURKC基因rs1008073、rs2302060 位點的基因型和等位基因頻率比較

圖3 AURKC基因rs1008073、rs2302060 位點連鎖不平衡分析

3 討論

精子的發生是一個極其精密而有序的過程，受到許多因素的影響，如內分泌激素和基因，其中任何環節出現問題都會改變精子的生理結構，導致精子形態的異常，影響生育能力，其中基因異常導致精子發生異常最為多見[8-10]。大頭多尾精子癥是畸形精子癥中的一種[11]，與其相關的主要基因是極光激酶C(AURKC)基因[12]。極光激酶A、B和C蛋白是細胞周期調節酶，確保在細胞分裂過程中紡錘體裝置的準確形成。在精子發生過程中，AURKC蛋白保證了染色體在減數分裂和胞質分裂過程中的準確分離[13]。

表5 單倍型在畸形精子癥組和對照組中的分布

AURKC基因位于人染色體19q13，有7個外顯子，在人體內編碼309個氨基酸蛋白，到目前為止，已報道的SNP主要有6個：c.144delC、c.686G>A、c.744C>G、c.930+38G>A、c.436-2A>G及c.269G>a[14]。其中AURKC.144delC是最常見的大頭精子癥的遺傳原因，約1/10000男性會有，這一頻率對于導致生殖缺陷的突變來說非常高[15]。因此，在6個SNP里，c.144delC的研究也最多，Dieterich K等[2]對來自北非的10名不育男性進行了全基因組微掃描，在Aurora C的編碼區發現了c.144delC突變，這些男性的精子幾乎是100%的四倍體。Kerch FE等[3]在西非地區對18例畸形精子癥患者研究時，在試驗組AURKC基因中檢測出了純合c.144delC突變。Khelifa MB等[4]在研究歐洲和非洲87例典型大頭多尾精子癥患者時發現，試驗組中有85%的患者帶有c.144delC突變。研究表明[16]，c.144delC突變造成一個移碼，導致氨基酸49處的亮氨酸到色氨酸密碼子的變化，而移碼后的22個錯義殘基是翻譯終止密碼子，導致蛋白質截短，這種改變使AURKC的催化結構域始于42位，導致激酶結構域幾乎完全丟失，從而降低染色體乘客復合體(CPC)對染色體的定位能力，使精原細胞不能完成減數分裂I，當減數分裂失敗時，而精子發生又未受影響，就會導致四倍體多個鞭毛精子的形成。目前，國內有1例該問題的研究報道：穆雪梅等[17]在四川地區研究AURKC基因c.144delC位點與男性不育的相關性時，未能在AURKC基因中檢出 c.144delC突變。這可能是基因多態性具有地域、種族差異導致的結果，也有可能是由于樣本量少、實驗條件有限、各種風險因素資料缺乏等關系引起。本次研究的rs1008073和rs2302060位點也與畸形精子癥的發病風險無相關性，因此這2個位點不能作為畸形精子癥發病風險的分子遺傳標記。

綜上所述，AURKC基因多態性與男性畸形精子癥的研究在國外男性群體發現不同研究結論，但在我國僅有少數研究，且多為單一國外人群陽性位點的驗證。本次研究的2個位點與畸形精子癥無相關性，所以下一步我們需要尋找更多、更適合的位點進行深入研究，提高實驗條件，收集更多的樣本，提高結論的可靠性。