萊菔硫烷對AlCl3誘導SH-SY5Y細胞周期和細胞凋亡抑制作用研究

韋俊宏，韋雨琪，黃與實，楊玲玲，李有幸，王一涵，岑育芳，龐雅琴

(右江民族醫學院，廣西 百色 533000)

鋁在自然界中含量豐富，隨著經濟的發展，鋁被廣泛地應用于工農業的生產和日常生活中，鋁暴露主要由于職業接觸和日常生活[1]。隨著鋁制品的大量生產使用以及食品添加劑的廣泛使用，使鋁暴露損害人體的可能性日益增加，也愈來愈受到人們的關注。大量研究表明[2-5]，鋁對神經系統具有毒性作用，這種毒性作用主要表現為對學習與記憶功能的損害，日常生活能力進行性減退，并出現神經精神癥狀和行為障礙，且隨著暴露劑量增加而行為功能出現嚴重的改變，最終發展為阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)。鋁誘導的神經毒性引起神經元細胞減少，這種神經毒性與鋁誘導產生的體內活性氧的氧化損傷有關[6]，同時，可導致星形膠質細胞抗氧化功能失調，從而引起大腦疾病[7]。萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是廣泛存在于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸鹽，有抗凋亡、調節氧化應激和改善機體免疫等多種生物學功能[8]；同時SFN對機體神經細胞有明顯的保護作用[9]。但萊菔硫烷是否能夠緩解鋁誘導的神經毒性？這需要進一步探討。為此，本研究探討SFN對鋁誘導的神經毒性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養的試劑 DMEM溶液(HyClone公司)、胎牛血清(Gibco公司)、磷酸鹽溶液(PBS)、胰蛋白酶溶液(Solarbio公司)、0.1%明膠溶液等。

1.1.2 主要試劑 AlCl3溶液，購自上海研卉生物技術公司 ；人核糖核酸酶(RNASE)，購自上海研生公司；Hoechst 33258染色液，購自Solarbio公司；碘化丙啶，購自Solarbio公司；聚丙烯酰胺，購自Promega公司；細胞周期檢測試劑盒，購自Baomanbio公司；凋亡檢測試劑盒，購自Biosciences公司；Western Blot蛋白一抗抗鼠(Sigma公司)，二抗山羊抗兔(Santa Cruz公司)；等電聚焦膠條(13 cm pH 4～7)；SFN，購自武漢天植生物公司。

1.2 細胞株及培養 人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)細胞株(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心)，用含15%胎牛血清的DMEM培養基進行培養， 37℃、5% CO2，飽和濕度條件下培養，隔天換液，胰蛋白酶消化以后進行傳代。

1.3 方法

1.3.1 AlCl3對SH-SY5Y細胞染毒及SFN的干預作用 取對數生長期的SH-SY5Y細胞，用AlCl3對其進行染毒24 h，測定LC50，選擇SH-SY5Y細胞死亡率低于5%或10% LC50作為最高劑量組，設3個實驗組和1個溶劑對照組。對于SFN的干預作用，分別采用0 μM 、2.5 μM 、5 μM 、10 μM SFN預處理SH-SY5Y 24 h后，再同時用5 mM AlCl3進行染毒24 h。

1.3.2 細胞周期的檢測 取對數生長期細胞，制成單細胞懸液，以1.25 ×105/ml密度接種于T-25培養瓶中，24 h后加入各濃度AlCl3(0.625 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L)培養24 h，收集所有細胞，將約1×106個細胞移入離心管中，1000 r/min離心5 min，棄去上清液后，用PBS溶液清洗1次，在離心管中留約0.5 ml PBS溶液，加入70%冰乙醇5 ml混勻固定，4℃放置48 h以上。檢測時離心管用乙醇、PBS溶液清洗1次，在離心管中留1 ml PBS溶液，打散細胞團，加入Rnase (10 mg/ml)，37℃放置1 h，加入碘化丙啶(pI)(100 μg/ml)染液，室溫避光染色30 min，計數10000個細胞，流式細胞儀檢測細胞周期時相和凋亡情況，進行細胞凋亡的分析。

1.3.3 Hochest法檢測細胞凋亡的形態 取對數生長期細胞 8×105/ml，接種于6孔板，每孔1 ml，細胞貼壁后棄去原培養液，PBS洗2次，加入不同濃度AlCl3，培養48 h后細胞分為兩部分，一部分行pI染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞核形態變化。取潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5 min，用PBS溶液洗滌3次，再用細胞培養液洗滌1次。將蓋玻片置于6孔板內，種入細胞培養過夜。刺激細胞發生凋亡后，吸盡培養液，加入0.5 ml固定液，固定10 min，去固定液，用PBS溶液洗2次，每次3 min，吸盡液體。洗滌時手動晃動數次，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min，同時也用手動晃動數次，用PBS溶液洗2次，每次3 min。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，避免氣泡，使細胞接觸封片液，熒光顯微鏡觀察細胞形態變化。

1.3.4 周期相關蛋白和凋亡相關蛋白的測定 將染毒后的SH-SY5Y細胞離心回收，加入提前配制好的蛋白質裂解液將細胞混勻使其裂解，離心10 min (12 000 r/min、4℃)，回收蛋白質上清。將15 μg 的總蛋白在聚丙烯酰胺凝膠上進行凝膠電泳，電泳后將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，封閉后用抗 Cyclin D1、P27、P21 、Cyto C、Caspase 9、Caspase 3一抗(1∶2000)在4℃下孵育過夜。棄去一抗后用TBST緩沖液(含0.2% Tween-20、15 mmol /L氯化鈉和10 mmol/L Tris-Hcl) 洗滌5次，每次5 min，與HRP標記二抗孵育2 h，洗膜、ECL顯色、成像并分析結果。

2 結果

2.1 AlCl3對SH-SY5Y細胞周期的影響 通過流式細胞儀檢測SH-SY5Y細胞周期時相和凋亡情況，結果發現，染毒24 h后，0.625 mM 、1.25 mM 、2.5 mM 、5 mM AlCl3能誘導SH-SY5Y細胞周期阻滯。與對照組相比，0.625 mM 、1.25 mM 、2.5 mM 、5 mM AlCl3引起G0/G1期延長、S期、G2/M期縮短(P均<0.05)。見圖1。

注：與對照組相比，*：P<0.05。圖1 AlCl3誘導SH-SY5Y細胞周期阻滯

2.2 流式細胞儀檢測AlCl3誘導SH-SY5Y細胞凋亡的情況 采用0 mM、0.625 mM、1.25 mM、2.5 mM、5 mM AlCl3進行染毒，觀察AlCl3對SH-SY5Y細胞細胞凋亡的影響，結果發現，染毒24 h后，流式細胞儀檢測發現0.625 mM、1.25 mM、2.5 mM、5 mM AlCl3能誘導SH-SY5Y細胞凋亡。結果表明，0.625 mM、1.25 mM、2.5 mM、5mM AlCl3染毒組的凋亡率為8.21%、11.72%、15.72%、24.13%，與對照組相比，差異均有統計意義(P<0.05)。見圖2。

注：與對照組相比，*：P<0.05。圖2 流式細胞儀檢測AlCl3(mM)誘導SH-SY5Y細胞的凋亡

2.3 Hochest法檢測AlCl3對SH-SY5Y細胞凋亡的影響 Hochest染色表明，AlCl3作用于SH-SY5Y細胞24 h后，培養SH-SY5Y，采用0 mM、0.8 mM、1.6 mM、3.2 mM AlCl3進行染毒，觀察AlCl3對SH-SY5Y細胞凋亡的影響，結果發現，染毒24 h后，各劑量組均出現凋亡征象，表現為細胞核內可見濃染致密的藍色熒光顆粒及明顯核形態變化，并且隨著濃度的增高凋亡現象越明顯，與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

圖3 Hochest法檢測AlCl3(mM) 誘導SH-SY5Y細胞的凋亡

2.4 免疫印跡法檢測AlCl3對SH-SY5Y細胞周期相關蛋白Cyclline D1、 P27、P21和凋亡相關蛋白Cyto C、Caspase 9、Caspase 3表達的影響 采用0～3.2 mM AlCl3進行染毒，觀察AlCl3對SH-SY5Y細胞周期相關蛋白Cyclline D1、P27、P21和凋亡相關蛋白Cyto C、 Caspase 9、Caspase 3表達的抑制作用，結果發現，染毒24 h后，0.8 mM、1.6 mM、3.2 mM AlCl3可誘導SH-SY5Y細胞周期相關蛋白Cyclline D1、P27、P21和凋亡相關蛋白Cyto C、 Caspase 9、Caspase 3的表達，與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 AlCl3對SH-SY5Y細胞周期相關蛋白Cyclline D1、P27、P21和凋亡相關蛋白Cyto C、 Caspase 9、Caspase 3表達的影響

2.5 流式細胞儀檢測SFN對AlCl3對SH-SY5Y細胞周期阻滯和細胞凋亡的影響 培養SH-SY5Y，配制AlCl3溶液，分別采用0 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM SFN預處理SH-SY5Y細胞24 h后，再同時用5 mM AlCl3進行染毒24 h，觀察SFN對AlCl3誘導SH-SY5Y細胞周期阻滯的抑制作用，與對照組相比，2.5 μM、5 μM、10 μM SFN預處理后，引起G0/G1期縮短，S期、G2/M期延長，與對照組相比，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖5。與對照組相比，1.25 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM SFN預處理后，細胞凋亡率為為13.53%、11.52%、7.23%、5.84%，與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

注：與對照組相比，*：P<0.05。圖5 SFN抑制AlCl3誘導SH-SY5Y細胞的周期阻滯

2.6 SFN抑制 AlCl3誘導SH-SY5Y細胞的周期阻滯和凋亡相關蛋白的表達 分別采用0 μM 、2.5 μM 、5 μM 、10 μM SFN預處理SH-SY5Y 24 h后，再同時用5 mM AlCl3進行染毒24 h，觀察SFN對 AlCl3誘導SH-SY5Y細胞周期相關蛋白Cyclline D1、 P27、 P21和凋亡相關蛋白Cyto C、 Caspase 9 、Caspase 3表達的抑制作用，結果表明，2.5 μM 、5 μM 、10 μM SFN預處理對AlCl3誘導的SH-SY5Y細胞周期相關蛋白Cyclline D1、 P27、 P21和凋亡相關蛋白Cyto C、 Caspase 9、Caspase 3表達具有抑制作用，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖7。

注：與對照組相比，*：P<0.05。圖6 SFN抑制AlCl3誘導SH-SY5Y的細胞凋亡

圖7 SFN抑制AlCl3誘導SH-SY5Y細胞周期相關蛋白Cyclline D1、P27、P21和凋亡相關蛋白Cyto C、Caspase 9、Caspase 3表達

3 討論

鋁是一種重要的職業病危害因素，大量研究表明[10]，長期鋁暴露，導致鋁作業工人體內鋁負荷增高。鋁在體內過量蓄積引起神經毒性，導致認知功能障礙并進一步誘發神經退行性疾病。體外實驗顯示，鋁引起的神經毒性的主要原因是使細胞凋亡[11]。鋁誘導的神經毒性機制主要是嚴重的氧化應激導致神經炎癥反應，最終導致細胞發生損傷，其損傷程度與染毒劑量呈正相關[12]。

本次實驗發現AlCl3對SH-SY5Y細胞有明顯的毒性，可降低細胞活力，并可誘導細胞凋亡，與樊瑾等[13]的研究結果相一致。鋁作用于SH-SY5Y細胞時，H-SY5Y細胞隨著AlCl3濃度的增加，細胞凋亡率也隨著增加。同時導致H-SY5Y細胞縮小、細胞變形、染色質聚集、胞核固縮，這與張立豐等[12]、龐雅琴等[14]研究結果相一致。

細胞分裂間期可以分成G1、S和G2期，G1期是遺傳物質準備階段，S期主要是遺傳物質復制階段，G1期向S期進展是細胞周期進程的關鍵點[15]，本次實驗發現，AlCl3能夠誘導SH-SY5Y細胞阻滯于G0/G1期，并且可以明顯增高細胞的凋亡水平，因而AlCl3可能通過阻滯SH-SY5Y細胞G0/G1期誘導細胞凋亡。Cyclline D1蛋白是細胞周期G0/G1期的檢查點蛋白，P27參與接觸抑制和TGF-β等導致的細胞周期停止，P21參與P53介導的細胞周期停止。本次實驗發現，AlCl3對SH-SY5Y細胞Cyclline D1蛋白呈低表達水平，對P27、P21蛋白呈高表達水平，Cyclline D1低表達表明AlCl3誘導的SH-SY5Y細胞阻滯于G0/G1期。P27、P21蛋白高表達表明AlCl3誘導的SH-SY5Y細胞周期受到抑制。細胞周期是機體發育、細胞生長的基礎，細胞周期受抑制，細胞活化增殖能力降低，細胞凋亡率增加。

Caspase家族是細胞凋亡的執行者，細胞凋亡時，Caspase 3激活誘導線粒體釋放出CytoC，Caspase 9酶原與釋放出來的CytoC結合形成凋亡復合體誘導細胞凋亡。在本實驗中，凋亡相關蛋白CytoC、Caspase 9、Caspase 3蛋白的表達水平逐漸上升，細胞凋亡率也隨著染毒濃度的增加而增加，這可能是由于SH-SY5Y細胞在AlCl3的作用下的應激反應，從而凋亡相關蛋白Cyto C、Caspase 9、Caspase 3表達升高，調節細胞增殖的生物學作用。

SFN存在于十字花科蔬菜中，是一種天然的、有效性抗氧化劑，有很好的神經保護作用[9]，SFN通過激活Nrf2-ARE信號通路，增強機體抗氧化能力[16]，這種抗氧化能力對神經的保護有重要意義。SFN具有解毒重金屬、拮抗有害金屬元素的功能[17]，它能夠使神經細胞對各種金屬元素毒性的抵抗力顯著增強，從而進一步增加神經細胞的存活率。

SFN干預作用下AlCl3誘導的SH-SY5Y細胞阻滯于G0/G1期縮短，S期和G2/M期延長，這說明經過SFN干預后，SH-SY5Y細胞的活化增殖能力顯著升高，因而SFN可抑制細胞周期阻滯，導致細胞凋亡發揮保護SH-SY5Y細胞的作用。細胞凋亡的檢測中，實驗顯示，在SFN預處理AlCl3誘導H-SY5Y細胞，隨著SFN濃度的增加，SH-SY5Y細胞的凋亡率降低，存活率增加，同時，SFN預處理對AlCl3誘導的SH-SY5Y細胞周期相關蛋白Cyclline D1、 P27、 P21和凋亡相關蛋白Cyto C、 Caspase 9、Caspase 3表達具有抑制作用。說明本次實驗SFN對SH-SY5Y細胞具有正向干預作用，這與Huang C[16]、周伏園等[17]研究結果相一致。

綜上所述，AlCl3可以阻滯SH-SY5Y細胞周期并誘導細胞凋亡，同時我們的研究證實，SFN可以有效抑制AlCl3誘導SH-SY5Y細胞的凋亡，對SH-SY5Y細胞具有保護作用，從而緩解AlCl3誘導的神經毒性。