腫節(jié)風(fēng)HPLC-MS 指紋圖譜建立

鄧 攀,董 文,黃素榮,劉旭海,劉 勇,陳小榮,朱明輝

(1.江中藥業(yè)股份有限公司,江西 南昌 330004;2.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004)

腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.) Nakai 的干燥全草[1],具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)的功效,可用于治療上呼吸道感染、骨折等諸多疾病[2-3]。腫節(jié)風(fēng)是江西特色道地藥材,商品藥材主要來源于野生草珊瑚資源,相關(guān)產(chǎn)品有復(fù)方草珊瑚含片、腫節(jié)風(fēng)片以及腫節(jié)風(fēng)注射液等[4-5]。《中國藥典》 是目前國內(nèi)各類中藥材的主要質(zhì)量檢測依據(jù),但對于大多數(shù)藥材而言,《中國藥典》 中的檢驗(yàn)指標(biāo)并不能全面反映藥材的藥用信息。長期以來對于中藥基礎(chǔ)化學(xué)研究的缺失,使得國人至今仍對諸多中藥材的有效成分缺少了解,這直接影響了中藥材的規(guī)范化質(zhì)量控制,并有礙于我國中藥產(chǎn)品走出國門[6]。

指紋圖譜技術(shù)是目前國際公認(rèn)的草藥制劑質(zhì)量控制技術(shù)[7],美國、英國、印度等國家和地區(qū)均將指紋圖譜納入其草藥制劑質(zhì)量控制范疇[8-9]。本研究在充分采集各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)代表性樣品基礎(chǔ)上,運(yùn)用HPLC-MS 技術(shù)開展腫節(jié)風(fēng)種源研究,建立雙柱串聯(lián)腫節(jié)風(fēng)指紋圖譜,并進(jìn)行成分分析,以期進(jìn)一步提升對對腫節(jié)風(fēng)藥材的質(zhì)量把控能力。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀、Waters2998 二極管陣列檢測器(美國Waters 公司)；KQ-500B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SECURA125-1CN 電子天平、SECURA224-1CN 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司]；Millipore Direct-Q3UV 超純水機(jī)(美國密理博公司)；標(biāo)準(zhǔn)藥篩(紹興市上虞張興紗篩廠)；MSQ PLUS 質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher 公司)。

1.2 試劑 對照品異嗪皮啶、腫節(jié)風(fēng)藥材、迷迭香酸、綠原酸,均購于中國食品藥品檢定研究院；質(zhì)譜乙腈(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；色譜甲酸(山東西亞化學(xué)股份有限公司)；色譜甲醇、乙腈(美國霍尼韋爾公司)；水為超純水。

1.3 藥材 腫節(jié)風(fēng)藥材均經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉勇老師鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai 的干燥全草。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 雙色譜柱,前柱Agilent 5HC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm),后柱Eclipse plus phenyl-Hexyl(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相0.1% 甲酸乙腈溶液(A) -0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫(0～15 min,15%A；15～60 min,15%～30%A；60～90 min,30%～60%A)；0～15 min,體積流量0.3 mL/min,其余時(shí)間體積流量0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波 長330 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取腫節(jié)風(fēng)藥材粉末(過3 號篩) 1.0 g,置于50 mL 三角瓶中,加入10 mL 60% 甲醇,超聲30 min,濾過,濾液經(jīng)0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜過濾,即得。

2.3 雙柱串聯(lián)模式確定 傳統(tǒng)的液相分離過程通常選擇單根短柱或單根長柱進(jìn)行HPLC 分離,但組分分離過程效果不佳。本研究運(yùn)用雙柱串聯(lián)模式開展各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)藥材組分HPLC 分析結(jié)果見圖1,雙柱串聯(lián)模式組分分離效果顯著優(yōu)于單根短柱及單根長柱HPLC 分離過程,雙柱串聯(lián)HPLC分離模式實(shí)現(xiàn)了腫節(jié)風(fēng)藥材各組分的極大化分離。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取腫節(jié)風(fēng)藥材,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次,得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 均小于0.25%,各共有峰相對峰面積RSD 均小于2.50%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取腫節(jié)風(fēng)藥材6 份,分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 均小于0.80%,各共有峰相對峰面積RSD 均小于3.00%。表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 雙柱串聯(lián)HPLC 分離結(jié)果比較

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取腫節(jié)風(fēng)藥材,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下,分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣,測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 均小于0.30%,各共有峰相對峰面積RSD 均小于2.50%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 腫節(jié)風(fēng)藥材指紋圖譜

2.5.1 指紋圖譜建立 對22 批不同產(chǎn)地樣本進(jìn)行HPLC分析,將各產(chǎn)地樣品測試數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件中,選擇S10 樣品圖譜作為參照指紋圖譜,并以中位數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法,同時(shí)結(jié)合多點(diǎn)校正法對各產(chǎn)地液相圖譜進(jìn)行匹配,結(jié)果見圖2。

分析結(jié)果顯示,各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)藥材確認(rèn)有10 個(gè)共有峰,見圖3。結(jié)合HPLC-MS 圖譜數(shù)據(jù)及對照品比對,確認(rèn)了共有特征峰2、7、9 分別為綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸成分。HPLC 與MS 技術(shù)相結(jié)合,即使在不同實(shí)驗(yàn)時(shí)期HPLC 色譜峰出峰時(shí)間略有偏移,也可以通過MS 圖譜確認(rèn)參照峰,進(jìn)而加以校正。

圖2 22 批樣品HPLC-MS 指紋圖譜

圖3 各成分HPLC-MS 對照指紋圖譜

2.5.2 相似度分析 按照上述數(shù)據(jù)處理方式,相似度評價(jià)結(jié)果見表2,22 批不同產(chǎn)地樣品的平均相似度為0.946,表明不同產(chǎn)地的腫節(jié)風(fēng)樣品色譜模式大致相似,其化學(xué)成分大致相同。

表2 22 批樣品相似度

為評價(jià)腫節(jié)風(fēng)藥材指紋圖譜在藥材真?zhèn)舞b別方面的有效性,選用腫節(jié)風(fēng)對照藥材和魚子蘭(腫節(jié)風(fēng)偽品) 進(jìn)行比對。結(jié)果見圖4,腫節(jié)風(fēng)對照藥材具備腫節(jié)風(fēng)對照指紋圖譜的10 個(gè)共有特征峰且相似度達(dá)0.925,而魚子蘭藥材僅具有特征峰9 (迷迭香酸),與腫節(jié)風(fēng)對照指紋圖譜存在顯著差異。表明,本研究建立的方法可以實(shí)現(xiàn)腫節(jié)風(fēng)藥材真?zhèn)舞b別。

2.5.3 聚類分析 鑒于腫節(jié)風(fēng)指紋圖譜信息的復(fù)雜性,運(yùn)用SPSS 16.0 軟件對圖譜進(jìn)行聚類分析[10]。將各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)共有特征峰導(dǎo)入SPSS 軟件,運(yùn)用組間連接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,并采用歐氏距離進(jìn)行樣品間距離計(jì)算,結(jié)果見圖5。當(dāng)判別距離為25 時(shí),S18～S20 號樣品單獨(dú)為一類C(四川),其他產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)樣品聚為一類。當(dāng)判別距離為12時(shí),剩余18 批腫節(jié)風(fēng)可以分為A (福建、廣東、浙江)、B (廣西、江西、湖南、湖北、重慶、貴州) 兩部分。表明,腫節(jié)風(fēng)藥材種源存在著顯著的產(chǎn)地特異性。

圖4 藥材真?zhèn)舞b別

3 討論

近年中藥材種源混亂,藥材質(zhì)量不斷下降影響中藥藥效,關(guān)乎臨床運(yùn)用。在本研究基礎(chǔ)上,可進(jìn)一步推進(jìn)譜效研究[11],以期為腫節(jié)風(fēng)藥材運(yùn)用打開新局面。本研究建立的方法精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng),可用于腫節(jié)風(fēng)藥材的質(zhì)量控制,較好地鑒別腫節(jié)風(fēng)藥材的真?zhèn)巍?/p>